Impiego di alcune tecniche di diagnosi per valutare la sanità delle sementi.

The products most commonly used for the fresh-cut sector are vegetables of which salads represent 74% of the market. Among processed salad, lamb's lettuce (Valerianella olitoria L.) is increasingly grown in Italy, for ready-to-eat production. In northern Italy, the crop is widely grown in the Bergamo province of Lumbardy. In the spring of 2008, a disease already reported in Italy caused by Phoma valerianellae, was repeatedly observed on many farms in this province with 15 to 35 % of losses in spring and autumn crops grown under plastic tunnels. During the training period several diagnostic techniques for assessing the level of Valerianella olitoria seed contamination by Phoma valerianellae were used. This pathogen known for a long time in our country, is also transmitted through seed. It is responsible for serious damages in lamb's lettuce crop. The causal agent is seed-borne and its rapid spread is largely explained by the use of infected seed produced in the same area by several seed companies. The aim of this work was to measure the level of infection of lamb's lettuce seeds by using in vitro and in vivo tests as well as to develop a molecular technique for quick and reliable detection of the pathogen in the seed. Two samples of 1000 seeds, coded 310 and 313, were tested for the presence of P. valerianellae. Isolations were made from seeds either non disinfected or surface disinfected for 1 min in 1 % sodium hypochlorite solution. The tested in vitro and in vivo assays on perlite and with filter paper have shown a level of seed infection of 15, 16.7 and 16.2%, respectively for the sample 310 and 5.6, 8.3 and 7% for the sample 313. Surface disinfection of seeds did not eliminate the contamination, which was reduced 3-4%. Isolates of P. valerianellae, from the different seed lots, tested for their pathogenicity on lamb's lettuce, caused typical disease 7 days after inoculation. Isolates that were confirmed virulent were placed in collection and subsequently used to develop a specific primer. For this purpose, isolates were subjected to DNA extraction and were identified through use of PCR technique. P. valerianellae sequences obtained were aligned to those stored in database and to the sequences obtained from reference samples purchased from the CBS. Variation within the internal transcribed spacer ( ITS1, 5.8S gene and ITS2 ) region of the rDNA was used to characterise the P. valerianellae strain and to design specific primer within the ITS region. To verify the specificity of primers a PCR assay using P. exigua and P. betae species as comparison was carried out. Our results confirm that seeds of lamb's lettuce frequently carry P. valerianellae. Among the advantages of in vitro assay on Potato dextrose agar emerged the possibility of detecting the presence of other pathogens, such as Botrytis cinerea, allowing a total monitoring of seed health. Use of in vivo assay reduced the occurrence of contamination by Mucor spp. and Rhizopus spp., which are able to grow rapidly on agar media, making it difficult to continue the analisys. Instead, availability of a specific primer for P. valerianellae is a recommended strategy which allows to identify the presence of contaminated seeds. Detection of the fungus in seed lots may help farmers to manage the disease through rational sanitation efforts, such as seed dressing, and also discourage the commercial sale of contaminated seed.

La quarta gamma rappresenta uno dei più importanti sviluppi dell'offerta di produzioni ortofrutticole e le insalate costituiscono il 74% del mercato. La valerianella (Valerianella olitoria L.) è uno degli ortaggi a foglia intensamente coltivati in Lombardia per tale settore produttivo. Nella primavera del 2008, è stato osservato un aggravarsi degli attacchi di Phoma valerianellae, patogeno già noto su tale coltura in Italia e responsabile di perdite di produzione nel periodo primaverile e autunnale comprese tra il 15 e il 35 %. P. valerianellae è trasmissibile mediante seme, e nel corso dell'attività di tirocinio sono state impiegate alcune tecniche di diagnosi per valutare il livello di contaminazione dei semi di Valerianella olitoria dal patogeno. La valutazione è stata effettuata su due campioni di seme, identificati con i codici 310 e 313 e rispettivamente appartenenti alla cultivar Trophy e cultivar Palace. Sono stati impiegati saggi in vivo su perlite e su carta da filtro e saggi in vitro su mezzo agarizzato (PDA) addizionato con streptomicina solfato (25 ppm). Nel corso delle valutazioni i semi sono stati impiegati tal quale o trattati in una sospensione di ipoclorito (1%) per un minuto.Le analisi condotte in condizioni controllate su 1000 semi a campione hanno evidenziato un livello di infezione dei semi nel saggio in vitro, in vivo su carta e su perlite rispettivamente del 15%, 16,7% e 16,2% per il campione 310 e del 5,6%, 8,3% e 7% per il campione 313. Il lavaggio dei semi con ipoclorito si sodio ha mediamente ridotto del 3-4% la contaminazione dei semi da P. valerianellae. Gli isolati di P. valerianellae ottenuti da seme infetto sono stati identificati al microscopio ottico e immediatamente saggiati per la conferma della patogenicità su valerianella cv Trophy. Gli isolati di cui veniva confermata la virulenza sull'ospite sono stati posti in collezione e successivamente utilizzati per lo sviluppo di un primer specifico. A tal fine gli isolati di P. valerianellae sono stati sottoposti ad estrazione del DNA e sono stati identificati attraverso l'uso della tecnica PCR. È stata amplificata la regione ITS1-5.8S-ITS2 dell'RNA ribosomiale contenente la subunità 5.8S utilizzando i primer ITS1 e ITS4. Le sequenze degli isolati di P. valerianellae ottenute dai semi sono state allineate con quelle di P. valerianellae depositate in banca dati e con le sequenze ottenute dai campioni di riferimento acquistati presso il CBS. Sulle regioni di diversità sono stati costruiti i primer specifici.Per la verifica della specificità dei primer è stata effettuate una PCR impiegando le specie P. exigua e P. betae come confronto. Tra i vantaggi dell'impiego del saggio in vitro su mezzo agarizzato è emersa la possibilità di evidenziare la presenza anche di altri patogeni, quali Botrytis cinerea, consentendo un monitoraggio complessivo della sanità del seme. L'uso del saggio in vivo ha invece ridotto la manifestazione di contaminazioni da Mucor spp.e Rhizopus spp. in grado di svilupparsi rapidamente su mezzi agarizzati rendendo difficoltosa la prosecuzione dell'analisi. La disponibilità di un primer specifico per P. valerianellae è invece una strategia consigliabile e consente di individuare in modo specifico e veloce la presenza di semi contaminati da P. valerianellae risultando uno strumento utile per l'adozione di adeguate strategie di prevenzione come la concia fisica del seme o all'esclusione dei campioni altamente contaminati dal patogeno.