Determinazione dell'Aflatossina M1 nei formaggi

Mycotoxins (MT) are toxic metabolites produced by filamentous fungi, characterized by thermal stability and the ability to act at low concentrations. These properties facilitate contamination of the food chain, both during cultivation and in storage and transport phases. Among the most dangerous mycotoxins is Aflatoxin M1 (AFM1), derived from Aflatoxin B1, which has toxicological, genotoxic, immunotoxic, and mutagenic effects. Its presence poses a threat to public health as well as the economy, with estimated losses in the billions of euros. Cheese is particularly vulnerable to the accumulation of AFM1 due to its affinity for casein proteins. This vulnerability gives rise to the necessity for the aforementioned thesis project, which aims to verify the concentration of AFM1 in cheese using various analytical techniques and to evaluate any increases compared to the levels present in the milk used for cheese production. An additional goal of this work is to contribute to the research project on the "Definition of the concentration factors of aflatoxin M1 during the processing of hard cheeses, utilizing an experimental protocol for the extraction of AFM1 from cheeses. This protocol represents an alternative to traditional extraction methods, which usually require complex procedures, specific equipment, and the use of highly volatile chemicals that may be hazardous to operators. The study involved the analysis of 12 samples of semi-hard cheese from the Experimental Zooprophylactic Institute of Lombardy and Emilia Romagna to determine the presence of AFM1 using ELISA and HPLC-FLD tests, following an experimental extraction protocol. Additionally, 5 samples of cheese were produced from raw milk through experimental cheesemaking, including "negative" cheeses free of AFM1 and "positive" cheeses spiked with AFM1 at specific concentrations. After production, these samples were analyzed using the same techniques. The whey obtained during cheesemaking was examined using ELISA to detect the presence of AFM1. From the analysis of the samples, it was observed that the concentration of AFM1 significantly increases in cheese compared to that in the starting milk due to concentration processes during transformation. The method used to detect AFM1 demonstrated some effectiveness but presented challenges related to variability in recoveries and the complexity of analysis, especially given the limited number of samples examined. The study represents a first step toward developing more reliable analytical techniques, although further refinement is necessary for large-scale application. The future goal will be to improve the methodology further so that it can become a valid tool for routine monitoring of AFM1 contamination in cheese and contribute to the definition of limit parameters for dairy products.

Le micotossine (MT) sono metaboliti tossici prodotti da funghi filamentosi, caratterizzati da termostabilità e capacità di agire a basse concentrazioni. Queste proprietà facilitano la contaminazione della catena alimentare, sia durante la coltivazione sia nelle fasi di stoccaggio e trasporto. Tra le micotossine più pericolose c'è l'Aflatossina M1 (AFM1), derivata dall'Aflatossina B1, che ha effetti tossicologici, genotossici, immunotossici e mutageni. La sua presenza rappresenta una minaccia sia per la salute pubblica che per l’economia, con perdite stimate in miliardi di euro. Il formaggio è particolarmente vulnerabile all'accumulo di AFM1 per l'affinità con le proteine caseiniche, e, per questo motivo, nasce l’esigenza del suddetto progetto di tesi, il cui obiettivo è quello di verificare, mediante diverse tecniche analitiche, la concentrazione di AFM1 nel formaggio e di valutare eventuali aumenti rispetto ai livelli presenti nel latte per la produzione del formaggio stesso. Un ulteriore scopo di questo lavoro è contribuire al progetto di ricerca sulla “Definizione dei fattori di concentrazione di aflatossina M1 durante il processo di trasformazione di formaggi duri”, utilizzando un protocollo sperimentale di estrazione dell’AFM1 nei formaggi. Questo protocollo rappresenta un’alternativa ai metodi di estrazione tradizionali, che solitamente richiedono procedure complesse, apparecchiature specifiche e l’impiego di sostanze chimiche ad elevata volatilità, potenzialmente pericolose per gli operatori. Lo studio ha previsto l’analisi di 12 campioni di formaggio semi-duro, provenienti dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, per determinare la presenza di AFM1 utilizzando i test ELISA e HPLC-FLD, seguendo un protocollo sperimentale di estrazione. Inoltre, sono stati prodotti 5 campioni di formaggio da latte crudo mediante caseificazione sperimentale, con formaggi "negativi" privi di AFM1 e "positivi" addizionati di AFM1 a concentrazioni specifiche. Dopo produzione, questi campioni sono stati analizzati con le stesse tecniche. I sieri ottenuti durante la caseificazione sono stati esaminati tramite ELISA per rilevare la presenza di AFM1. Dallo studio dei campioni analizzati, è stato osservato che la concentrazione di AFM1 aumenta significativamente nel formaggio rispetto a quella nel latte di partenza, a causa dei processi di concentrazione durante la trasformazione. La metodica utilizzata per rilevare l'AFM1 ha dimostrato una certa efficacia, ma ha presentato criticità legate alla variabilità dei recuperi e alla complessità dell'analisi, specialmente per il numero ridotto di campioni esaminati. Lo studio rappresenta un primo passo verso lo sviluppo di tecniche analitiche più affidabili, sebbene sia necessario un perfezionamento per un'applicazione su larga scala. L’obiettivo futuro sarà quello di migliorare ulteriormente la metodologia, affinché possa diventare uno strumento valido per il monitoraggio routinario della contaminazione da AFM1 nel formaggio e possa contribuire alla definizione di parametri limite anche per i prodotti lattiero-caseari.