Incorporazione di un colorante cianinico in nanoparticelle di silice mesoporosa per applicazioni in terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)

In recent years, the spread of antimicrobial resistance (AMR) has stimulated intensive research into alternative therapies to antibiotics. Among the various strategies, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) has emerged as a promising, non-invasive technique that can be used to combat infections, especially in the orthodontic and orthopaedic fields. Photodynamic therapy consists of irradiating a photosensitiser (PS) at the wavelength of its absorption maximum to induce the production of reactive oxygen species (ROS). These ROS can then interfere with cellular structures leading to tumour (in the case of anti-cancer PDT) or bacterial cell death (in the case of aPDT). The aim of this project is to develop a new PS that absorbs radiation in the NIR, thus allowing greater penetration of light into tissues. Among the multiple PS, polymethine dyes, such as cyanines and squaraines, have proved to be particularly promising due to their intense absorption in the red and NIR and their efficient production of ROS. However, these dyes suffer from instability and low solubility in physiological media that limit their application in aPDT. To overcome these problems, studies have been conducted on the incorporation of PS into different types of nanocarriers. Some of these studies have shown greater activity against bacteria in the nanosystem containing PS, compared to free PS. The first step of this thesis was to synthesise a new polymethine dye, in particular a heptamethine cyanine, which shows an absorption peak in the NIR at 800 nm. During the synthesis, a quaternarization of the indolenin nitrogen was carried out with an alkyl chain containing a carboxyl group (Br-Cy7-COOH). This functional group was introduced with the aim of binding the dye to amine functionalised silica nanoparticles through an amide coupling reaction. The covalent bond between the dye and the nanoparticle can prevent the dye from desorption and increase the stability of the nanosystem. Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) were synthesised at the Inorganic Chemistry Department of the Universidad Complutense of Madrid. The synthesis was carried out using a microemulsion method that resulted in nanoparticles with a size of approximately 160 nm. These nanoparticles were then functionalised with APTES in order to coat the surface with amine groups. In addition to allowing the binding of the dye, it was shown that the presence of protonated amine groups on the surface can increase the selectivity of the nanosystem by targeting the negative charges of the bacteria's outer wall. Finally, the antibacterial activity of the dye alone was evaluated against Gram positive model bacteria (Staphylococcus aureus) and Gram negative model bacteria (Escherichia coli). The results showed that, the antimicrobial activity of Br-Cy7-COOH in aPDT is evident against S. aureus, even at low concentrations of 50 nM, while it appears to be less effective against E. coli bacteria.

Negli ultimi anni, la diffusione della resistenza agli antibiotici (AMR) ha stimolato un'intensa attività di ricerca su terapie alternative agli antibiotici. Tra le varie strategie, la terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) è emersa come una tecnica promettente e non invasiva che può essere utilizzata per combattere le infezioni, soprattutto in ambito ortodontico e ortopedico. La terapia fotodinamica consiste nell'irradiare un fotosensibilizzatore (PS) alla lunghezza d'onda del suo massimo di assorbimento per indurre la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Questi ROS possono quindi interferire con le strutture cellulari portando alla morte delle cellule tumorali (nel caso della PDT antitumorale) o batteriche (nel caso della aPDT). L'idea di questo progetto è di sviluppare un nuovo PS che assorba la radiazione nel NIR, permettendo così una maggiore penetrazione della luce nei tessuti. Tra i numerosi PS, i coloranti polimetinici, come le cianine e le squaraine, si sono dimostrati particolarmente promettenti grazie al loro intenso assorbimento nel rosso e nel NIR e alla loro buona produzione di ROS. Tuttavia, questi coloranti soffrono di instabilità e bassa solubilità nei mezzi fisiologici che ne limitano l'applicazione in aPDT. Per ovviare a questi problemi, sono stati condotti studi sull'incorporazione di PS in diversi tipi di nanocarriers. Alcuni di questi studi hanno mostrato una maggiore attività nei confronti dei batteri del nanosistema contenente il PS, rispetto al solo PS libero. In questa tesi, come primo passo è stato sintetizzato un nuovo colorante polimetinico, una cianina eptametinica, che mostra un picco di assorbimento nel NIR, a 800 nm. Durante la sintesi è stata effettuata una quaternizzazione dell'azoto dell'indolenina con una catena alchilica contenente un gruppo carbossilico (Br-Cy7-COOH). Questo gruppo funzionale è stato introdotto con l'obiettivo di legare il colorante a nanoparticelle di silice funzionalizzate con gruppi amminici, attraverso una reazione di amide coupling. Il legame covalente tra il colorante e la nanoparticella può impedire al colorante di desorbire dalla nanoparticella e aumentare la stabilità del nanosistema. Le nanoparticelle di silice mesoporosa (MSN) sono state sintetizzate presso il Dipartimento di Chimica Inorganica dell'Universidad Complutense di Madrid. La sintesi è stata effettuata con un metodo di microemulsione che ha permesso di ottenere nanoparticelle con una dimensione di circa 160 nm. Queste nanoparticelle sono state poi funzionalizzate con APTES, al fine di ricoprire la superficie con gruppi amminici. Oltre a permettere il legame con il colorante, è stato dimostrato che la presenza di gruppi amminici protonati sulla superficie può aumentare la selettività del nanosistema, mirando alle cariche negative della parete esterna dei batteri. Infine, è stata valutata l'attività antibatterica del solo colorante contro batteri modello Gram Positivi (Staphylococcus aureus) e Gram Negativi (Escherichia coli). I risultati hanno mostrato che, l'attività antimicrobica della Br-Cy7-COOH in aPDT è evidente nei confronti di S. aureus, anche a basse concentrazioni di 50 nM, mentre sembra non essere meno efficace contro i batteri E. coli.