Analisi d'espressione genica di Lactococcus lactis in prodotti lattiero-caseari

Il ruolo di Lactococcus lactis nella fase fermentativa di trasformazione del latte in cagliata e nelle prime fasi di stagionatura è noto da tempo. Negli ultimi anni numerosi lavori scientifici ipotizzano la presenza di questo batterio vivo e metabolicamente attivo anche durante la maturazione dei formaggi, sottolineando il problema di una non totale conoscenza dei processi microbiologici che si susseguono in fase di stagionatura. Lo sviluppo di tecniche d'analisi coltura-indipendenti, basate sull'analisi diretta di DNA ed RNA, ha permesso una conoscenza più approfondita delle dinamiche microbiche che si instaurano in matrici alimentari, in particolare nei prodotti lattiero-caseari. Durante questo lavoro di tesi è stato messo a punto un protocollo di Real Time PCR volto alla rilevazione ed alla quantificazione di popolazioni di L. lactis in matrici lattiero-casearie complesse, nelle quali l'elevata concentrazione salina e la scarsità di fonti di carbonio si ripercuotono sulla velocità di crescita e sullo stato fisiologico del microrganismo rendendo difficile, se non impossibile, il suo isolamento su terreni selettivi. Per l'ottimizzazione di questo protocollo sono state disegnate quattro coppie di primers sulle regioni codificanti e conservate dei geni housekeeping del promotore tuf e della proteinasi HtrA; in conformità a prove di specificità di questi primers su L. lactis e ad analisi della stabilità dell'espressione dei geni housekeeping presi in esame, è stata individuata in tuf 2 la coppia di primers più affidabile per la realizzazione del protocollo di rilevazione, andando a stabilire un limite di rilevabilità delle popolazioni batteriche pari a 10³ CFU g⁻¹ per campioni di DNA analizzati con qPCR ed uno di 10⁴ CFU g⁻¹ per RNA analizzato con qRT-PCR. Il protocollo di Real Time PCR è stato quindi testato su campioni di crosta e pasta di tre formaggi stagionati, Fontina DOP, Castelmagno DOP e Raschera d'Alpeggio DOP. A livello di crosta di Fontina DOP, grazie all'analisi del DNA estratto, è stato registrato che durante le fasi di produzione della Fontina DOP si sviluppano popolazioni di L. lactis aventi cariche pari a 10⁷ - 10⁸ CFU g⁻¹. L'analisi di qRT-PCR realizzata sull'RNA ha invece evidenziato una popolazione vitale di L. lactis nel campione al 28mo giorno di stagionatura; in fase più avanzata della maturazione, con l'analisi dell'RNA estratto da pasta, non sono state evidenziate popolazioni del lattococco quantificabili. Al contrario, l'analisi realizzata su campioni di pasta di Castelmagno DOP e Raschera d'Alpeggio DOP al termine della fase di maturazione ha registrato rilevanti popolazioni di L. lactis metabolicamente attivo (10⁴ CFU g⁻¹ per Castelmagno DOP, 10⁶ CFU g⁻¹ per Raschera d'Alpeggio DOP). I dati proposti in questo progetto di tesi confermano l'ipotesi di una presenza viva e vitale di L. lactis anche in fase avanzata di stagionatura di alcuni prodotti lattiero-caseari, sottolineando il ruolo di questi microrganismi in fase avanzata di maturazione. In futuro, con nuove analisi qPCR, sarà possibile iniziare a comprendere il ruolo che ricoprono questo batterio ed il suo metabolismo nella produzione di aromi, andando a valutare l'espressione di geni tecnologici in fase di stagionatura del formaggio.