SLN contenenti didodecilmetotrexate preparate con la tecnica della coacervazione: primi studi di efficacia

Nowadays glioblastoma represents the most aggressive brain cancer. This is due to its high infiltration capacity, but also to the numerous anatomical barriers for administered drugs, first of all the blood-brain barrier (BBB). Studies in vivo on animal glioma models are essential to improve the knowledge about this tumor and to develop effective therapies. Currently different models are used, such as xenograft models, orthotopic allogenic models, syngenic models and GEM (Genetically Engineered Mouse) models. In order to overcome the obstacles related with the drug delivery within central nervous system (CNS), researchers are studying new technological approaches such as liposomes, micelles and nanoparticles, and MRI and immunohistochemical analysis are used to monitor tumor growth. The purpose of this thesis was the preparation of behenic acid solid lipid nanoparticles (SLN) with the fatty acids coacervation technique, linked with proteins or peptides, for the entrapment of didodecylmethotrexate (ddMTX), a lipophilic diester of MTX, the. In this thesis I also tested the efficacy of these SLN on an aggressive glioma syngeneic rat model (F98-Fischer), suitable to simulate the conditions of human cancer. ddMTX-loaded SLN were preliminarly tested in vitro on F98 cells, used for the implantation, and they showed excellent cytotoxicity, even higher than cytotoxicity against primary human glioblastoma cells. Studies in vivo on rats revealed that ddMTX-loaded SLN, functionalized with transferrin or with a peptide chimera able to bind the apolipoprotein E (ApoE) receptor, when administrated intravenously, lead to a greater drug accumulation in the brain, without particular differences between healthy and tumor implanted rats, and a greater permanence in the bloodstream than free drug. The immunohistochemistry analysis, performed both with Caspase and Tunel assay, showed a higher level of apoptosis in CNS with SLN treated tumors, compared to untreated tumors or temozolomide (reference drug) treated tumors, although the tumor growth rate measured in MRI was similar.

Il glioblastoma rappresenta a oggi il tumore cerebrale più aggressivo conosciuto. Ciò è dovuto alla sua elevata capacità infiltrante, ma anche alle numerose barriere anatomiche che i farmaci somministrati incontrano per giungere al tumore, prima tra tutte la barriera emato-encefalica (BEE). Per migliorare le conoscenze sullo sviluppo e l'evoluzione di questo tumore e cercare di mettere a punto una terapia efficace, si rendono essenziali gli studi in vivo su modelli animali di glioma. Attualmente vengono utilizzati diversi modelli, come lo xenograft, l'ortotopico allogenico, il singenico e il GEM (Genetically Engineered Mouse). Per cercare di aggirare gli ostacoli legati al raggiungimento del sistema nervoso centrale (SNC) da parte del farmaco, si stanno studiando nuovi approcci tecnologici basati sull'utilizzo di liposomi, micelle e nanoparticelle, mentre per monitorare i tumori indotti si ricorre alla MRI e all'analisi immunoistochimica. Lo scopo della tesi è la messa a punto di nanoparticelle lipidiche solide (SLN) di acido beenico, preparate con la tecnica della coacervazione degli acidi grassi e modificate superficialmente tramite l'utilizzo di peptidi e proteine, per l'inglobamento di un diestere lipofilo del MTX, il didodecilmetotrexate (ddMTX). In questa tesi si è anche cercato di sperimentare l'efficacia di tali SLN su un modello di glioma di ratto singenico (F98-Fischer), sufficientemente aggressivo e idoneo a simulare le condizioni del tumore umano. Preliminarmente, le SLN caricate con ddMTX sono state testate in vitro sulle cellule F98, utilizzate per l'impianto, mostrando di possedere un'ottima citotossicità, persino maggiore rispetto a quella verso le cellule di glioblastoma primario umano. Gli studi in vivo sui ratti hanno rivelato che le SLN caricate con ddMTX e funzionalizzate con transferrina o con un peptide chimera in grado di legarsi al recettore dell'apolipoproteina E (ApoE), somministrate per via endovenosa, portano a un maggiore accumulo del farmaco al cervello, senza particolari differenze tra ratti sani e ratti impiantati con tumore, oltre ad una maggiore permanenza nel plasma rispetto al farmaco libero. L'analisi immunoistochimica del tessuto tumorale, condotta sia con il saggio della Caspasi che con il Tunel, ha rivelato che i tumori trattati con SLN mostrano un livello di apoptosi cellulare a livello del SNC più alto di quelli non trattati o trattati con temozolomide (farmaco di riferimento), sebbene la velocità di crescita del tumore misurata in RMI non sia molto differente.