L'ossidosqualene ciclasi (OSC) è uno degli enzimi più importanti e studiati della biosintesi degli steroli: catalizza la formazione del primo precursore ciclizzato degli steroli, nelle cellule animali e fungine, il lanosterolo, ed è considerato un buon target per farmaci antifungini ed ipocolesterolemici. Inoltre in studi recenti è risultato essere un buon target anche per potenziali agenti anti-cancerosi. Nel 2004 è stata risolta la struttura dell'enzima umano OSC[1]. L'analisi strutturale dell'OSC umana ha rivelato le caratteristiche essenziali del sito attivo ed ha evidenziato la presenza di due canali colleganti la cavità del sito attivo con la superficie della proteina, uno lipofilo verso la zona di inserimento dell'enzima nella membrana del reticolo endoplasmatico, uno polare verso il compartimento citosolico. Si suppone che il primo canale permetta al substrato ossidosqualene di accedere al sito attivo idrofobico. Il canale idrofobico è già stato studiato nell'enzima OSC di S. cerevisiae mediante mutagenesi sito-specifica dei residui aminoacidici coinvolti; questi studi hanno confermato il ruolo essenziale che ha, per la catalisi enzimatica, il mantenimento della struttura del canale[2]. Ad oggi non si conosce ancora il ruolo specifico del canale polare, anche se si ipotizza un suo coinvolgimento nell'attività catalitica dell'enzima. In base ai dati cristallografici, il residuo di glutammato E459 appare essere il residuo di collegamento tra il canale polare e la cavità interna del sito attivo: questo residuo è collegato mediante ponti idrogeno con i due residui aminoacidici di glutammina Q394 e lisina K462. In questa tesi è stato approfondito il ruolo del canale polare, andando a mutagenizzare i residui Q394 e K462 e valutando successivamente l'effetto delle mutazioni sull'attività catalitica dell'enzima. Per la posizione 394 sono stati progettati e preparati i mutanti Q394N e Q394K in cui la glutammina è stata sostituita rispettivamente con l'asparagina (residuo aminoacidico dotato di caratteristiche polari simili all'aminoacido nativo) e la lisina (aminoacido polare carico). Per quanto riguarda la posizione 462 sono stati progettati e preparati i mutanti K462R e K462Q dove la lisina è stata sostituita rispettivamente con l'arginina (lasciando invariata la carica della catena laterale) e con la glutammina (aminoacido polare non carico). Parallelamente si è completata la caratterizzazione del mutante K462A preparato in una tesi precedente. I mutanti sono stati ottenuti mediante mutagenesi sito-specifica e sono stati espressi in cellule del lievito Pichia pastoris: l'espressione della proteina mutata è stata valutata mediante Western Blot e l'attività specifica delle proteine mutate presenti negli omogenati di cellule di P. pastoris è stata confrontata con quella della proteina OSC umana nativa. Tutti i mutanti sono risultati attivi anche se con attività specifiche molto differenti se paragonate a quella della proteina umana nativa, in alcuni casi (come per il mutante Q394R e K462A) ridotte anche del 60-80%. I dati ottenuti confermano l'importanza del canale polare nella capacità dell'OSC di ciclizzare il lanosterolo.

Mutagenesi sito-specifica a livello dei residui di glutammina 394 e lisina 462 dell'enzima ossidosqualene ciclasi umano

DI RAIMONDO, MARIA CRISTINA
2011/2012

Abstract

L'ossidosqualene ciclasi (OSC) è uno degli enzimi più importanti e studiati della biosintesi degli steroli: catalizza la formazione del primo precursore ciclizzato degli steroli, nelle cellule animali e fungine, il lanosterolo, ed è considerato un buon target per farmaci antifungini ed ipocolesterolemici. Inoltre in studi recenti è risultato essere un buon target anche per potenziali agenti anti-cancerosi. Nel 2004 è stata risolta la struttura dell'enzima umano OSC[1]. L'analisi strutturale dell'OSC umana ha rivelato le caratteristiche essenziali del sito attivo ed ha evidenziato la presenza di due canali colleganti la cavità del sito attivo con la superficie della proteina, uno lipofilo verso la zona di inserimento dell'enzima nella membrana del reticolo endoplasmatico, uno polare verso il compartimento citosolico. Si suppone che il primo canale permetta al substrato ossidosqualene di accedere al sito attivo idrofobico. Il canale idrofobico è già stato studiato nell'enzima OSC di S. cerevisiae mediante mutagenesi sito-specifica dei residui aminoacidici coinvolti; questi studi hanno confermato il ruolo essenziale che ha, per la catalisi enzimatica, il mantenimento della struttura del canale[2]. Ad oggi non si conosce ancora il ruolo specifico del canale polare, anche se si ipotizza un suo coinvolgimento nell'attività catalitica dell'enzima. In base ai dati cristallografici, il residuo di glutammato E459 appare essere il residuo di collegamento tra il canale polare e la cavità interna del sito attivo: questo residuo è collegato mediante ponti idrogeno con i due residui aminoacidici di glutammina Q394 e lisina K462. In questa tesi è stato approfondito il ruolo del canale polare, andando a mutagenizzare i residui Q394 e K462 e valutando successivamente l'effetto delle mutazioni sull'attività catalitica dell'enzima. Per la posizione 394 sono stati progettati e preparati i mutanti Q394N e Q394K in cui la glutammina è stata sostituita rispettivamente con l'asparagina (residuo aminoacidico dotato di caratteristiche polari simili all'aminoacido nativo) e la lisina (aminoacido polare carico). Per quanto riguarda la posizione 462 sono stati progettati e preparati i mutanti K462R e K462Q dove la lisina è stata sostituita rispettivamente con l'arginina (lasciando invariata la carica della catena laterale) e con la glutammina (aminoacido polare non carico). Parallelamente si è completata la caratterizzazione del mutante K462A preparato in una tesi precedente. I mutanti sono stati ottenuti mediante mutagenesi sito-specifica e sono stati espressi in cellule del lievito Pichia pastoris: l'espressione della proteina mutata è stata valutata mediante Western Blot e l'attività specifica delle proteine mutate presenti negli omogenati di cellule di P. pastoris è stata confrontata con quella della proteina OSC umana nativa. Tutti i mutanti sono risultati attivi anche se con attività specifiche molto differenti se paragonate a quella della proteina umana nativa, in alcuni casi (come per il mutante Q394R e K462A) ridotte anche del 60-80%. I dati ottenuti confermano l'importanza del canale polare nella capacità dell'OSC di ciclizzare il lanosterolo.
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