Approccio analitico alla valutazione del carry-over da farmaci negli alimenti ad uso zootecnico

Tetracyclines are antibiotics, authorised and extensively used in the prophylaxis and therapy of animal infections and also they can be admistered in animal feed. Usually, different compound feeds have to be manufactured in the same production line, one after the other. At the switch-over from one product to the next, traces of the first product may remain in the production line and get mixed with the first batches of the next product. The transfer from one production batch to the following batch is called ¿carry-over¿, which may result in cross-contamination if some undesirable materials are transferred. So that, trace amounts of drugs are incorporated into feeds that should not contain them. Usually affected are batches obtained just after production of a medicated feed that legally contains the drug in question. Feeding these contaminated feeds may lead to the presence of residues in the animals products and antibiotic resistance events. The EU Commission is developing a new Regulation, in order to establish the carry over maximum tolerable limits of veterinary drugs in feed. Detection of unauthorized use of pharmaceuticals requires highly sensitive, selective methods, which have to be developed, in order to fulfill the requests of the National Animal Feed Plan (PNAA). The aim of this thesis was to develop a multiresidue HPLC-DAD method for detection and quantification of tetracyclines in feed at carry over level. Extraction of the analytes is performed on sample grinded with solvent, then a purification step is carried out through Metal Chelate Affinity Chromatography (MCAC), followed by a SPE C18 concentration phase. Analytes (Oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline, Doxycycline) are split through HPLC on RP18 column, identified with UV-VIS spectrum, and quantified with internal standardization and calibration curve of spiked samples at 5 concentration levels. The performance of the method is evaluated according to Regulation (EC) 882/2004 criteria. All parameters taken into account are satisfactory (linearity, LOD, LOD, specificity, trueness/recovery, stability), therefore this method fits for purpose of the official control. The LOQ (1 mg/kg) is qualified to detect tetracyclines in feed at carry over level, which corresponds to 1% of minimum therapeutic level. This method is suitable both for screening and confirmatory analyses, as DAD detector provides a high selectivity, based on molecular spectroscopy. Moreover, the equipment needed is commonly available in chemical laboratories.

Le tetracicline sono antibiotici autorizzati in medicina veterinaria e ampiamente utilizzati per la profilassi e la terapia. In ambito zootecnico questi medicinali possono essere somministrati tramite l'impiego di mangimi medicati. Poichè negli stabilimenti di produzione per lo più non esistono linee diversificate per i mangimi medicati e quelli bianchi (non contenenti il farmaco), si può verificare il fenomeno del carry-over o contaminazione crociata, con conseguente presenza di residui del farmaco negli alimenti e incremento delle condizioni atte a promuovere e trasferire l'antibiotico resistenza. A livello comunitario è allo studio un regolamento che fissi dei limiti massimi tollerabili di farmaco a seguito di carry-over inevitabile in produzione Da ciò, emerge la necessità di mettere a punto un metodo d'analisi per la rilevazione quantitativa delle tetracicline autorizzate in alimenti ad uso zootecnico a livelli di contaminazione crociata, da utilizzare per i controlli ufficiali su campioni prelevati dai Servizi Veterinari delle ASL nell'ambito del Piano Nazionale per i controlli sull'Alimentazione Animale (PNAA). Oggetto della presente tesi è stato lo sviluppo di un metodo di prova multiresiduo per la determinazione quantitativa delle tetracicline negli alimenti ad uso zootecnico a livello di carry-over mediante cromatografia liquida accoppiata a detector UV a foto diodi (High Performance Liquid Chromatography - HPLC-UV/DAD). La procedura prevede, dopo l'estrazione degli analiti dal campione macinato con solvente, una fase di purificazione dell'estratto grezzo mediante Metal Chelate Affinity Chromatography (MCAC) seguita da concentrazione mediante estrazione in fase solida (Solid Phase Extraction - SPE C18); gli analiti (ossitetraciclina, tetraciclina, clortetraciclina e dossiciclina) sono separati mediante HPLC su colonna RP18, identificati mediante spettro di assorbimento UV-VIS e quantificati mediante standardizzazione interna e retta di taratura in matrice "ante". Le prestazioni del metodo sono state valutate durante il processo di validazione in accordo ai requisiti del Regolamento CE 882/2004: tutti i parametri valutati (linearità, LOD, LOQ, specificità, esattezza, ripetibilità, robustezza e stabilità) sono risultati soddisfacenti, per cui il metodo è idoneo all'utilizzo per i controlli ufficiali. Il LOQ del metodo (1 mg/kg) è idoneo alla ricerca delle tetracicline in AUZ a livello di carry-over in quanto corrisponde all'1% della dose terapeutica minima. Il metodo può esser utilizzato sia per analisi di screening che di conferma, in quanto il rivelatore DAD permette l'identificazione univoca dell'analita basata su tecniche di spettroscopia molecolare. Inoltre la strumentazione richiesta, rappresentata da un HPLC con rivelatore DAD, rientra nella normale dotazione dei laboratori chimici.