induzione di transizione epitelio-mesenchima da parte di Serpina B3 in cellule di epatoblastoma umano HepG2 e possibile ruolo modulatore di ipossia

Aree di ipossia sono rintracciate in molte neoplasie, compreso il carcinoma epatocellulare (HCC), e dati recenti indicano come l'ipossia possa indurre transizione epitelio-mesenchima (EMT) ed aumento della capacità invasiva in varie linee cellulari tumorali umane comprese le cellule HepG2. Si ritiene che il processo di EMT, sia un meccanismo cruciale per acquisire un fenotipo maggiormente invasivo da parte di numerose neoplasie. Dati sperimentali evidenziano come in cellule neoplastiche dell'HCC e in cellule del tessuto cirrotico circostante sia osservabile l'espressione aberrante della Serpina B3 (S-B3), proteina inibitrice delle serino- proteasi di cui sono state descritte l'azione anti-apoptotica e di promozione della crescita neoplastica. L'espressione della S-B3, è stata inoltre correlata con la progressione dell' HCC. In questa tesi sono riportati esperimenti per verificare l'ipotesi che la S-B3 possa indurre EMT utilizzando come modello sperimentale le cellule HepG2 (cellule a bassa deviazione di epatoblastoma umano). Inoltre, sono stati condotti ulteriori esperimenti in vitro ed in vivo al fine di indagare le relazioni tra condizioni di ipossia e l'espressione della S-B3. In esperimenti preliminari abbiamo verificato come cellule HepG2, esposte a due distinte isoforme di serpina ricombinante, S-WT (wild type) e S-PD (mutata), siano andate incontro ad una tipica EMT, documentata dalla downregolazione della E-caderina, dall'aumentata espressione dell'α- SMA e traslocazione nucleare di SNAIL, dall'inibizione della fosforilazione di GSK-3β dall'acquisizione di un fenotipo fibroblastoide nonché da una aumentata invasività associata ad un aumento di attività delle metalloproteasi 2 e 9. Per avere conferma di tali dati sono state utilizzate cellule HepG2 transfettate stabilmente in modo da iperesprimere la S-B3; i dati ottenuti indicano che tali cellule rilasciano nel mezzo di coltura S-B3 capace di indurre a sua volta EMT in cellule HepG2. Ulteriori esperimenti, per identificare i meccanismi molecolari evocati dalla S-B3, hanno consentito di verificare come l'inattivazione/fosforilazione della GSK-3β (snodo cruciale del processo di EMT) sia associata all'attivazione delle vie di segnalazione Ras/Erk e PI-3K dipendente dalla produzione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS), verosimilmente di origine mitocondriale. Esperimenti svolti in condizioni ipossia controllata hanno consentito di verificare come sia la trascrizione del RNAm specifico che la sintesi della S-B3, siano notevolmente incrementate e controllate dagli stessi meccanismi già citati. In particolare, utilizzando specifici siRNA è stato possibile stabilire come l'espressione della S-B3 in condizioni di ipossia sia controllata da HIF-2α (e non da HIF-1α). L'esistenza di una possibile relazione tra la presenza di ipossia e l'espressione della S-B3 è stata ulteriormente confermata da analisi immunoistochimiche condotte su sezioni seriali di campioni bioptici ottenuti da fegati di pazienti cirrotici e portatori di HCC (eziologia HCV, grading G1 e G2) che evidenziano un aumento nelle stesse aree di tessuto neoplastico o cirrotico dell'immunopositività sia per S-B3 che per HIF-2α. In conclusione, i dati indicano che, in condizioni di ipossia, la S- B3, può essere secreta nel terreno di coltura ed è capace di indurre nelle cellule vicine un processo di EMT ed è verosimilmente coinvolta nel processo di epatocancerogenesi.