Nuovi metodi analitici per l'analisi qualitativa dei fosfolipidi di membrana

Introduction. The fundamental physical parameters of the membrane (such as bilayer thickness, phase-transition temperature) are influenced by the chemical identities of their constituent phospholipids (headgroup charge, degree of unsaturation and acyl chain length), so a fully chemical structure identification of lipids is very important. Mass spectrometry is a powerful analytical approach for lipid structure recognition. Aim. The aim of this research carried out at Durham University - UK (Chemistry Department), was to establish and develop validated analytical methods for identifying unknown phospholipids in mixtures, which could ultimately be applied to the analysis of lipid bilayers. Results. Mass spectrometry tandem EID - Electron Induced Dissociation - allowed to identify clearly phosphocholine and phosphoethanolamine lipids, using compound representative of each type (OPPC, POPC, POPE). All the phospholipid chemical structure was recognized: i.e. the headgroup, the chains, the position and geometry of double bond. Indeed zooming and looking at the fragmentation of the precursor ion [M +H]+, all the lipids spectra could be divided properly in three different parts, regrouping peaks that corresponded to the different chemical structure parts of lipids (headgroup, chains, oleoyl chain fragmentation and double bond). The various structure parts were identified through peaks related to their proper ions, their neutral loss, through their pieces or fragments that contained them. The range of metals suitable for inclusion in analytical phospholipids samples to promote selective fragmentation pathways was explored. The addition of calcium to OPPC and POPC samples has given interesting and significant results. In particular analyzing couples of peaks concerning the lipid chains, their intensities were found reversed in OPPC compared to POPC spectrum. These differences should be due to the inverted position of chains in two lipids, and they have allowed to identify unequivocally OPPC and POPC. In an extension of this project, synthesis and analysis of novel fluorescent phospholipids liposomes with potential applications in spectroscopy and microscopy have been studied. Conclusions. The results obtained in this project showed MS/MS EID is a valid and accurate technique for the identification of phospholipids. In addition, the use of metals ions allowed the distinction between isomeric structures as OPPC and POPC.

Introduzione. Parametri fisici fondamentali delle membrane cellulari come lo spessore del doppio strato e la temperatura di transizione di fase, sono influenzate dalle caratteristiche chimiche dei loro costituenti fosfolipidici (carica della testa polare, grado di insaturazione, posizione del doppio legame, lunghezza delle catene aciliche); perciò una completa identificazione della struttura dei lipidi è molto importante. La spettrometria di massa costituisce un potente mezzo analitico per il riconoscimento strutturale dei lipidi. Scopo della tesi. Lo scopo di questo progetto di ricerca, svolto alla Durham University (Chemistry Department), è stato quello di stabilire e sviluppare metodi analitici convalidati per l'identificazione di miscele di fosfolipidi incogniti, che potrebbero in ultima analisi essere applicati all'analisi dei doppi strati lipidici. Discussione dei risultati. La tecnica di spettrometria di massa tandem EID, Electron Induced Dissociation, ha permesso di identificare chiaramente lipidi fosfocolinici e fosfoetanolaminici, utilizzando composti rappresentativi per ciascun tipo (OPPC, POPC, POPE). Tutta la struttura chimica dei fosfolipidi è stata riconosciuta: la testa polare, le catene, la posizione e la geometria dei doppi legami. Infatti, osservando la frammentazione dello ione precursore [M + H]+, gli spettri dei lipidi possono essere propriamente suddivisi in tre diverse parti, raggruppando i picchi corrispondenti ai diversi componenti strutturali (testa, catene, frammentazione della catena oleica e doppio legame). Sono stati successivamente esplorati una serie di sali metallici, aggiunti durante le analisi dei campioni dei fosfolipidi, al fine di promuovere percorsi selettivi di frammentazione. L'aggiunta di calcio ai campioni OPPC e POPC ha dato risultati molto interessanti e significativi. In particolare, analizzando coppie di picchi relativi alle catene lipidiche, le loro intensità erano invertite negli spettri OPPC rispetto a quelli di POPC. Queste differenze dovrebbero essere dovute alla posizione opposta delle catene stesse nei due lipidi, e tali diversità hanno permesso di identificare in modo inequivocabile OPPC da POPC. Estendendo questo progetto di ricerca, è stata approfondita la sintesi e l'analisi di nuovi liposomi fosfolipidici fluorescenti, con potenziali applicazioni nel campo della spettroscopia e microscopia. Conclusioni. I risultati ottenuti in questo progetto hanno dimostrato come MS/MS EID sia una tecnica molto valida ed accurata per l'identificazione di fosfolipidi. Inoltre, l'uso di ioni metallici ha consentito la distinzione tra strutture isomeriche come OPPC e POPC.