Costruzione di marcatori fluorescenti per organuli di Saccharomyces cerevisiae e studio degli effetti della deplezione di fosfoatidilinositolo-4,5-bisfosfato.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è, forse, il microrganismo eucariota più studiato: la sua rapida crescita in terreni di coltura chimicamente definiti, il ciclo vitale in due fasi (aploide e diploide), l'assenza di patogenicità, il sistema di trasformazione di DNA ad alta efficienza1 rendono questo organismo uno dei modelli più adeguati per lo studio di processi biologici Lo sviluppo di questi sistemi di trasformazione ha fatto sì che il lievito sia particolarmente accessibile per la clonazione di geni e lo sviluppo di tecniche di ingegneria genetica2. La parete cellulare è un fattore chiave nella cellula di lievito essendo incaricata al darle forma, supporto fisico e protezione. Il percorso di integrità cellulare (¿cell integrity pathway¿) svolge un ruolo chiave nel mantenere una parete cellulare stabile, dinamica durante tutta la vita della cellula adattandosi ai cambi e modificandosi a seconda delle richieste fisiologiche. Il percorso di integrità cellulare si attiva in determinati momenti del ciclo cellulare o in conseguenza di stimoli differenti che influenzano la parete cellulare (stimoli fisici, come cambi di temperatura, o stimoli chimici, come la presenza di composti che danneggiano la parete)3. Quando il percorso di integrità cellulare manca di uno dei suoi elementi, le cellule diventano più sensibili a particolari stimoli chimici e fisici a causa dell'instabilità della parete cellulare. La membrana subisce, in queste condizioni, una perdita di permeabilità selettiva che in molti casi conduce alla morte per lisi cellulare. Il fosfatidil inositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) è un lipide essenziale per la cellula di lievito considerando che, tra le sue varie funzioni, determina l'attivazione del percorso di integrità cellulare mediata dalle MAPK (Mitogen-activated protein kinases). È stato osservato che l'espressione eterologa di PI3K di mammifero in cellule di lievito provoca la deplezione di PIP2 , con la conseguente delocalizzazione di vari componenti, tra cui la protein chinasi C1 (Pkc1), dalla membrana plasmatica a compartimenti citoplasmatici ancora non identificati4. In questo contesto si inserisce lo studio realizzato, che ha avuto come obiettivi: (1) ottenere nuovi marcatori cellulari in fusione C-terminale alla proteina fluorescente rossa (mCherry) per l'osservazione di mitocondri (ILV6), perossisomi (PEX3), P-bodies (DCP1), Golgi (ANP6), in Saccharomyces cerevisiae; (2) determinare se l'espressione eterologa di PI3K influisce sulla morfologia/localizzazione degli organuli citati; (3) cercare di co-localizzare Pkc1-GFP in presenza di PI3K. Per questi motivi è stata prodotta una collezione di fusioni geniche di proteine a localizzazione subcellulare nota in un vettore marcato TRP1 nel quale è stata introdotta la sequenza codificante della proteina fluorescente mCherry. La conferma attraverso la microscopia e l'immunoblot dell'esito delle costruzioni realizzate e l'osservazione che l'espressione di PI3K non influisce su nessuno di questi organuli, hanno permesso di concludere che il compartimento cellulare nel quale si localizza Pkc1 in condizioni di deplezione di PIP2 non corrisponde con nessuno di questi organuli.