Il secretoma di cellule endoteliali infettate con il virus citomegalico umano stimola angiogenesi e linfoangiogenesi

Le cellule endoteliali rappresentano uno dei principali siti di replicazione produttiva disseminazione sistemica e persistenza nell'ospite del virus citomegalico umano (HCMV). Svolgono inoltre un importante ruolo nello sviluppo delle malattie vascolari associate all'infezione da HCMV. Sebbene sia stata osservata la presenza di antigeni e del DNA virale in tessuti linfonodali, la capacità di HCMV di infettare cellule endoteliali linfatiche (LEC) non è stata ancora analizzata a causa della mancanza di un apposito sistema colturale in vitro. La messa a punto di una metodologia che prevede due passaggi consecutivi di selezione immunomagnetica, ci ha permesso di ottenere popolazioni omogenee di LEC (purezza del 98%) a partire da linfonodi normali. Le LEC così purificate sono state espanse in presenza di fattori di crescita endoteliali e del fattore specifico per le cellule endoteliali linfatiche VEGF-C (Vascular Epithelial Growth Factor C). Con l'utilizzo di queste popolazioni di LEC è stato possibile dimostrare che un isolato clinico di HCMV, il ceppo VR1814, che mantiene il suo naturale endoteliotropismo, è in grado di infettare in maniera produttiva le LEC e di alterare l'espressione di diversi geni cellulari coinvolti nella risposta infiammatoria associata al processo infettivo. Lo sviluppo del ciclo replicativo virale è stato monitorato nel tempo attraverso la ricerca di antigeni virali immediati precoci (IE), precoci (UL44) e tardivi (UL99) in cellule LEC infettate a diverse MOI (Multiplicity of infection). Successive analisi qualitative e quantitative mediante cytokine antibody arrays dei sovranatanti prodotti da LEC infettate hanno rivelato che l'infezione citomegalica induce la secrezione di diverse citochine, chemochine e fattori di crescita, molti dei quali sono coinvolti nella regolazione di diverse proprietà fisiologiche delle cellule endoteliali quali la migrazione e la differenziazione. Saggi funzionali, infatti, hanno dimostrato che il secretoma prodotto da LEC infettate con HCMV è in grado di stimolare l'angiogenesi sia nelle cellule endoteliali linfatiche ( LEC) sia in quelle del circolo sanguigno (BEC). In seguito mediante l'utilizzo di anticorpi monoclonali neutralizzanti è stato possibile dimostrare le attività di IL-6 e di GM-CSF, due tra le citochine più abbondanti presenti nel secretoma di LEC infettate da HCMV e maggiormente indotte dall'infezione virale, sono necessarie per conferite proprietà angiogeniche al secretoma HCMV -indotto. Il ruolo di IL-6 e GM-CSF nell'angiogenesi mediata da HCMV è stato poi ulteriormente confermato mediante l'utilizzo delle due citochine in forma ricombinante che hanno riprodotto, quando aggiunte al secretoma di LEC non infettate con HCMV, l'effetto angiogenico del secretoma HCMV-indotto. Nel loro insieme i risultati di questa tesi di laurea hanno permesso di dimostrare: 1) la permissività delle cellule LEC alla replicazione produttiva di HCMV; 2) l'induzione di un secretoma virus-mediato in grado di stimolare sia l'ematoangiogenesi che la linfoangiogenesi; 3) l'induzione della secrezione virus-dipendente di IL-6 e GM-CSF quale meccanismo principale della risposta angiogenica indiretta delle cellule endoteliali al secretoma derivato da cellule infettate con HCMV.