Effetti dell'inibizione dell'IkB chinasi nella Sindrome da Insufficienza Multiorgano indotta da Shock emorragico in un modello sperimentale in vivo

Hemorrhagic shock (HS) is a pathophysiological condition caused by a rapid and significant loss of intravascular volume, which can lead to tissue hypoperfusion, cell damage, organ damage and subsequent death. This physiological imbalance is characterized by different symptoms depending on a progressive response of the different organs involved. Multi organ failure syndrome (MOFS) is a well known complication of HS, which results from a complex interaction between the host's immune response and the significant decrease of perfusion mentioned above. The main target organs of this syndrome are the intestine, the lungs, the liver and the kidney. Nowadays, the clinical approach against HS occurs in three often overlapping segments: the resuscitation phase, the operative phase and the critical care phase (1). Activation of NF-kB transcription factor and it's translocation in the nucleus is widely implicated in MOFS (2), nevertheless, there is not a specific pharmacological treatment whose aim is to attenuate it's entity. IKβ kinase (IKK) plays a pivotal role in the propagation of this pro-inflammatory pathway signal and consequently it's inhibition could lead to a considerable reduction of inflammatory related states. The aim of this thesis is to analyze, for the first time, the effects of IKK inhibitor, IKK16, on MOFS associated with HS, focusing on the molecular mechanisms evoked by IKK16 administration. On this purpose, in collaboration with prof. Thiemermann (University of London, UK), hemorrhagic shock was performed in a murine experimental model, maintaining a mean arterial pressure (MAP) at 30 ± 2 mmHg. Afterwards followed resuscitation and rats were treated with 1mg / mL / kg of IKK16 or with 1mL / kg of DMSO vehicle at 10%. Four hours later blood and urine samples were collected and animals were sacrificed. After this liver, lungs and kidney were assessed for organ inury in Western Blot. Kidney and liver tissue from HS rats revealed an increase in phosphorylation of IKK and IKβ, NF-kB translocation in the nucleus and expression of inducible isoform of nitric oxide synthase (iNOS). In lung tissue was observed an increase of iCAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) expression. Compared to rats treated with only the vehicle, rats that had undergone HS showed attenuating activation of NF-kB signaling pathway after resuscitation and subsequent administration of IKK16. In addition, increased activation of the AKT cell survival pathway was detected in liver and kidney tissue and an increased phosphorylation of ERK1 / 2 protein kinases was observed only in the kidney. In conclusion, the results of this thesis confirm the ability of the IKK16 compound to interfere with the signal pathway of NF-kB and demonstrate how this inhibition impacts on other important intracellular signal cascades contributing significantly to attenuate MOFS associated with hemorrhagic shock. Kauvar DS, Wade CE. The epidemiology and modern management of traumatic hemorrhage: US and international perspectives. Critical Care.2005;9(Suppl 5): S1-S9. doi:10.1186/cc3779. A.Israël;The IKK Complex, a Central Regulator of NF-κB Activation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.2010;2(3): a000158

Lo shock emorragico (HS Hemorrhagic Shock) è una condiziona fisiopatologica prodotta da una rapida e significativa perdita del volume circolante intravascolare, che può portare ad ipoperfusione tissutale, danno cellulare, danno d'organo e successiva morte. Tale squilibro fisiologico è caratterizzato da sintomi diversi in base alla singola risposta progressiva dei vari organi coinvolti. La Sindrome da insufficienza multiorgano (MOFS Multi Organ Failure Syndrome) è una nota complicanza dell'HS, che deriva da una complessa interazione tra la risposta immunitaria dell'ospite e la già citata significativa ipoperfusione. I principali organi target affetti da tale sindrome sono l'intestino, i polmoni, il fegato e il rene. Oggigiorno, l'approccio clinico contro l'HS permette di intervenire in 3 momenti distinti: la fase di rianimazione, la fase caratterizzata da gli interventi chirurgici e la fase di cura eseguita in terapia intensiva (1). L'attivazione della cascata infiammatoria causata dalla traslocazione nucleare del fattore di trascrizione NF-kB, gioca un ruolo molto importante nell'insorgenza della MOFS (2), tuttavia non esiste un trattamento farmacologico mirato ad attenuare la sua entità. L'IKβ chinasi (IKK) è un precursore fondamentale nella propagazione del segnale di questo pathway proinfiammatorio e di conseguenza la sua inibizione potrebbe condurre ad una considerevole riduzione degli stati infiammatori associati (3). L'obiettivo di questa tesi è quello di analizzare, per la prima volta, gli effetti dell'inibitore di IKK, ovvero di IKK16, sulla MOFS associata ad HS. A questo scopo, in un modello sperimentale murino è stato indotto Shock emorragico mantenendo la pressione arteriosa media a 30±2 mmHg, per poi, a seguito della rianimazione, trattarli con 1mg/mL/Kg di IKK16 o con 1mL/Kg di veicolo DMSO al 10%. Dopo 4 ore dall'inizio dell'emorragia sono stati raccolti campioni di sangue e di urina. A seguito del sacrificio, gli organi (fegato, polmoni e reni) sono stati destinati all' analisi attraverso la tecnica del Western Blot. I risultati hanno mostrato che nei ratti sottoposti a HS vi era un aumento della fosforilazione di IKK e IKβ, un incremento della traslocazione di NF-kB nel nucleo e un aumento dell'espressione di iNOS e della molecola di adesione intracellulare iCAM-1. L'IKK16, somministrato durante la fase di rianimazione ha mostrato effetti attenuanti sull'attivazione della via di segnale dell'NF-kB nei ratti che avevano subito HS, rispetto ai ratti trattati con il solo veicolo. Inoltre, in fegato e reni è stata rilevata una maggiore attivazione della via di sopravvivenza cellulare AKT. Solo nel rene infine si è osservato anche un aumento della fosforilazione delle protein chinasi ERK1/2. In conclusione i risultati di questa tesi confermano la capacità del composto IKK16 di interferire con la cascata di segnale di NFkB e dimostrano come questa inibizione impatti su altre importanti cascate di segnale intracellulare contribuendo in maniera significativa ad attenuare la MOFS associata a Shock emorragico. Kauvar DS, Wade CE. The epidemiology and modern management of traumatic hemorrhage: US and international perspectives. Critical Care.2005;9(Suppl 5): S1-S9. doi:10.1186/cc3779. A.Israël;The IKK Complex, a Central Regulator of NF-κB Activation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.2010;2(3): a000158