Studio spettrofotometrico dell'interazione tra farmaci e DNA

DNA has been known to be the cellular target for many cytotoxic anticancer agents for several decades. Understanding how drug molecules interact with DNA has become an active research area at the interface between chemistry, molecular biology and medicine. The interaction between DNA and drugs can cause chemical and conformational modifications and, thus, variation of the electrochemical properties of nucleobases. For this reason binding studies play a vital role in the determination of the mechanisms of drug action and in the design of more efficient and specifically targeted drugs to reduce side effects. Basically, small ligand molecules interact with DNA by two different ways: covalent and non-covalent modes. Covalent binders act as alkylating agents because they alkylate the nucleotides of DNA. The non-covalent binders interact with three different ways: intercalation, groove binding and external binding (on the outside of the double helix). These interactions can be investigated by several instrumental techniques, in particular by spectroscopic approaches. UV¿Visible absorption spectroscopy is the simplest and most commonly employed instrumental technique for studying both the stability of DNA and their interactions with small ligand molecules. The study of drug¿DNA interactions could be carried out by monitoring the changes in the absorption properties of the complex formation. Fluorescence spectroscopy is another technique most commonly used to study this kind of interaction. The orientation of fluorophoric ligands and their closeness to the DNA pairs of bases can be studied by fluorescence anisotropy or Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Fluorescence quenching experiments give additional information concerning the localization of drugs and their mode of interaction with DNA. Interaction between calf-thymus DNA (ctDNA) and a note intercalating drug (Epirubicin) minor groove binder (Pentamidine and Diclofenac) and new synthetic molecules (sq uaraine) has been investigated by spectroscopic techniques to obtain thermodynamic association and dissociation constants. In the case of Epirubicin, Pentamidine and Diclofenac the kinetic pathway of complexation reaction between DNA and drugs has been investigated by employing stopped-flow fluorescence techniques to obtain kinetic constants such as kon and koff. This study is a starting point for a broader understanding of the possible causes of side effects and action mechanism of drugs. In addition to this, it could be a valid support for the synthesis and characterization of new molecules for therapeutic use in several diseases.

Ormai da molti anni è noto che il DNA sia il bersaglio cellulare per molti agenti antitumorali citotossici. Capire come i farmaci interagiscono con questo target è diventata un'area di ricerca molto attiva sia a livello chimico che a livello biologico e medico. L'interazione tra il DNA e i farmaci può infatti causare modifiche chimiche e conformazionali portando alla variazione delle proprietà elettrochimiche delle basi azotate. Per questo motivo gli studi di interazione svolgono un ruolo molto importante nella determinazione dei meccanismi di azione dei farmaci e nella progettazione di molecole più efficaci e con minori effetti collaterali. Fondamentalmente, piccole molecole interagiscono con il DNA in due modi differenti: attraverso legami covalenti e con legami non covalenti. Le molecole che agiscono attraverso la formazione di legami covalenti sono agenti alchilanti, poiché sono in grado di alchilare i nucleotidi del DNA. I leganti non covalenti, invece, interagiscono con tre diverse modalità: intercalazione, groove binders e legame elettrostatico (all'esterno della doppia elica). Queste interazioni non covalenti possono essere studiate con varie tecniche strumentali, in particolare attraverso l'uso di tecniche spettroscopiche. La spettroscopia di assorbimento UV-visibile è la tecnica strumentale più semplice e più comunemente impiegata per studiare sia la stabilità del DNA sia le sue interazioni con piccole molecole. Lo studio delle interazioni farmaco-DNA viene effettuata monitorando i cambiamenti nelle proprietà di assorbimento durante la formazione del complesso. La spettroscopia di fluorescenza è un'altra tecnica ampiamente utilizzata per studiare questi tipi di interazione. L'orientamento dei leganti fluoroforici e la loro vicinanza alle coppie di basi del DNA possono essere valutati attraverso l'anisotropia di fluorescenza o il Trasferimento di Energia di Risonanza di Fluorescenza (FRET). Esperimenti di quenching della fluorescenza forniscono, inoltre, ulteriori informazioni relative alla localizzazione dei farmaci e alla loro modalità di interazione con il DNA. In questo progetto sono state studiate attraverso tecniche spettroscopiche le interazioni tra il DNA del timo del vitello (ctDNA) con un noto intercalante (Epirubicina), dei minor groove binders (Pentamidina e Diclofenac) e delle nuove molecole di sintesi (squaraine), per ottenere le costanti termodinamiche di associazione e dissociazione. Nel caso dell'Epirubicina, della Pentamidina e del Diclofenac è stata valutata la cinetica di interazione di questi farmaci con il DNA attraverso l'utilizzo dello stopped-flow, un'altra tecnica spettroscopica di fluorescenza che permette di ricavare le costanti cinetiche, come kon e koff. Questo studio risulta, quindi, essere un punto di partenza per una più ampia comprensione delle possibili cause degli effetti collaterali e dei meccanismi d'azione dei farmaci. Inoltre, potrebbe essere un valido supporto per la sintesi e la caratterizzazione di nuove molecole ad uso terapeutico.