INIBIZIONE DELL'INFLAMMASOMA NLRP3: NUOVI METODI DI SCREENING IN VITRO PER VALUTARE L'ATTIVITÀ DI COMPOSTI DI SINTESI

The NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex that senses pathogen associated molecular patterns (PAMPs) or damage associated molecular patterns (DAMPs). Its activation induces caspase-1 activation and release of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18 and drives a peculiar form of cell death known as pyroptosis. It plays a crucial role in the innate immune system and its inappropriate activation contributes to the progression of many chronic inflammatory and age-associated diseases, thus the detection of molecules that selectively inhibit the NLRP3 inflammasome could be useful in the treatment of these diseases. This work focuses on the discussion of some assays that have been developed to evaluate the ability of new compounds to inhibit the NLRP3 inflammasome. The early aim of the project that includes this thesis was to obtain electrophile molecules with α,β-unsaturated carbonyls that can act as Michael acceptors in order to react with reactive residues of the inflammasome. The cysteine residues could be good targets for the formation of covalent bonds with the newly synthesized compounds, thus a method has been developed to evaluate their ability to react with cysteamine, a little molecule with a very reactive thiol group. In this assay the test compounds reacted with cysteamine and the amount of the remaining thiols has been determined by adding a specific reagent. However, this test couldn't be used for some molecules of the series, because an interference has been observed. For these compounds another method of analysis has been developed, in which the molecule reacted with an excess of cysteamine and the area of its peak is monitored with the HPLC-mass spectrometer. The possible decrease of the initial peak area and the formation of new peaks has been evaluated, and the mass spectra have helped us to interpret the identity of the molecules derived from the reaction between the coumpounds and cysteamine. In order to identify the specific target of the newly synthesized molecules, it was thought to evaluate the inhibition of the NALP3 enzyme, which catalyzes a crucial step of the activation of the inflammasome. Therefore, an enzymatic assay has been developed in order to evaluate the ability of these molecules to inhibit the ATPase activity of the NALP3 enzyme; we have focused our attention on the evaluation of the solubility of these compounds using UV spectroscopy, a crucial step in order to obtain reliable results. In this case, we have worked on a panel of molecules with different chimical structure, both with α,β-unsaturated carbonyls and without this substructure. The inhibition results we have obtained are repeteable and, for the active compounds, dose-dependent values.Therefore, in this work two rapid and versatile assays have been developed, which can be used for preliminary screening of possible NLRP3 inflammasome inhibitors. Moreover, the results that have been obtained can provide important information for the study of the crucial interactions that can be established between molecules and the ATPase site of the NALP3 enzyme.

L'inflammasoma NLRP3 è un complesso multiproteico che risponde a un gran numero di molecole di origine microbica (PAMPs) e di prodotti endogeni associati al danno cellulare (DAMPs), scatenando una cascata di eventi cellulari che determinano la secrezione delle citochine proinfiammatorie IL-1β e IL-18 e un particolare tipo di morte cellulare caspasi-dipendente detta piroptosi. Esso gioca un ruolo fondamentale nell'immunità innata e la sua attivazione inappropriata è associata a un gran numero di patologie infiammatorie croniche correlate all'età, quindi l'individuazione di molecole che blocchino selettivamente l'inflammasoma NLRP3 potrebbe avere un importante riscontro terapeutico. In questa tesi vengono illustrati e discussi alcuni metodi che sono stati messi a punto per valutare la capacità di nuovi composti di sintesi di inibire l'inflammasoma NLRP3. L'idea iniziale del progetto in cui si è inserita questa tesi era di ottenere molecole elettrofile portanti dei carbonili α,β-insaturi che fungano da accettori di Michael per reagire con porzioni reattive del complesso dell'inflammasoma. I residui cisteinici potrebbero essere dei buoni target per la formazione di legami covalenti con le molecole di nuova sintesi, quindi è stato messo a punto un metodo per valutare la capacità dei composti di reagire con la cisteamina, piccola molecola caratterizzata dalla presenza di un gruppo tiolico molto reattivo. In questo test i composti sono stati fatti reagire con la cisteamina ed è stata determinata la quantità di tioli residui mediante l'aggiunta di un reattivo specifico. Per alcuni dei composti studiati non è stato possibile utilizzare questo metodo, a causa di un'interferenza nel rivelamento. Per queste molecole è quindi stato messo a punto un metodo in cui il composto viene fatto reagire con un eccesso di cisteamina e monitorato con un HPLC-massa. È stata valutata l'eventuale diminuzione dell'area del picco di partenza e la formazione di nuovi picchi, i cui spettri di massa hanno consentito di determinare l'identità delle molecole che si formano dalla reazione con la cisteamina. Per cercare di individuare il target specifico delle molecole ottenute, si è pensato di valutare l'inibizione dell'enzima NALP3, che catalizza un passaggio fondamentale dell'attivazione dell'inflammasoma. È stato quindi messo a punto un test enzimatico per valutare la capacità dei composti di inibire l'attività ATPasica dell'enzima NALP3 isolato, prestando particolare attenzione alla valutazione della solubilità dei composti mediante spettroscopia UV, risultata un passaggio critico per ottenere valori di inibizione ripetibili. In questo caso sono state testate numerose molecole con diversa struttura chimica, sia portanti carbonili α,β-insaturi, sia prive di tale sottostruttura. I valori di inibizione ottenuti sono risultati ripetibili e, per i composti più attivi, anche dose dipendenti. Nella presente tesi sono quindi stati messi a punto due metodi rapidi e versatili, utilizzabili per screening preliminari di possibili inibitori dell'inflammasoma NLRP3. Inoltre i risultati ottenuti possono fornire informazioni preziose per lo studio delle interazioni fondamentali che si possono instaurare con il sito ATPasico dell'enzima NALP3.