Nanoparticelle lipidiche solide caricate con insulina:studi preliminari ex vivo ed in vivo.

Abstract Subcutaneous administration of insulin in diabetic patients is associated with the distress and difficulty of daily injections. Among alternative administration routes, the oral route seems to be the most advantageous for long-term administration, also because the peptide undergoes a hepatic first-pass effect, contributing to the inhibition of the hepatic glucose output. Unfortunately, insulin oral administration has so far been hampered by degradation by gastro-intestinal enzymes, and poor intestinal absorption, due to high molecular weight. Incorporating insulin in solid lipid nanoparticles (SLN) should have the effect of protecting the drug against proteolytic degradation and enhancing its absorption, also through the Peyer's patches. Nevertheless, insulin entrapment into SLN is hampered by its high molecular weight, hydrophilicity and thermo-sensitivity. In this thesis insulin encapsulation in SLN was obtained operating at mild temperatures with an hydrophobic ion-pairing (HIP) approach, coupled with the solvent-free fatty acid coacervation technique [1, 2]. Sodium dodecyl sulfate HIP, or polystyrene sulfonate complexation (polymer-lipid hybrid nanoparticles - PLN) were employed; glargine insulin was also used, owing to its modified aminoacidic sequence and solubility. Drug release in gastrointestinal medium was modulated according to the different encapsulation strategy employed. Stearic acid SLN were compared to stearic/oleic acid nanostructured lipid carriers (NLC). Bioactivity of lipid entrapped insulin was demonstrated through a suitable in vivo experiment. Ex vivo experiments, performed through the gut tied up method, showed a greater uptake of labelled NLC, compared to SLN. Selected NLC were loaded with fluorescently labelled insulins, that were previously synthesized and characterized: gut tied up experiments showed encouraging intestinal uptake of labelled insulin from NLC formulations. In future studies, the in vivo uptake will be investigated owing to a pharmacokinetic approach on healthy rats, by employing nanoparticles loaded with fluorescently labelled insulin. The role of gut lymphatic uptake will also be investigated through a thoracic duct cannulation experiment in healthy rats. Blood glucose responsivity assays will be performed later, because highly dependent on the animal model employed (healthy or diabetic) and on insulin absorption kinetic. References 1. Powers M.E.; Matsuura J.; Brassell J. et al. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. Biopolymers, 1993, 33, 927¿932. 2. Gallarate, M.; Battaglia, L.; Peira, E. et al. Peptide-loaded solid lipid nanoparticles prepared through coacervation technique 2011. International Journal of Chemical Engineering doi:10.1155/2011/132435.

Riassunto La somministrazione sottocutanea di insulina nei pazienti diabetici è associata con la difficoltà e la scomodità delle iniezioni giornaliere. Tra le vie di somministrazione alternative, la via orale sembra essere la più vantaggiosa per una somministrazione cronica, anche perché in questo modo il peptide andrebbe incontro al primo passaggio epatico, che potrebbe contribuire in modo più efficace all'inibizione della secrezione epatica del glucosio. Sfortunatamente, la somministrazione orale di insulina è stata finora ostacolata dalla degradazione da parte degli enzimi gastro-intestinali e dallo scarso assorbimento intestinale, a causa del suo elevato peso molecolare. L'incorporazione dell'insulina in nanoparticelle lipidiche solide (SLN) dovrebbe avere l'effetto di proteggere il farmaco dagli enzimi proteolitici e di aumentarne l'assorbimento, anche attraverso le placche di Peyer. Tuttavia, l'inglobamento dell'insulina in SLN è ostacolato dal suo alto peso molecolare, dalla sua idrofilia, e dalla sua termosensibilità. In questa tesi l'incapsulazione dell'insulina in SLN è stata ottenuta operando a temperature non elevate tramite l'utilizzo delle coppie ioniche idrofobe (HIP), associate alla tecnica della coacervazione degli acidi grassi, che non fa uso di solventi [1, 2]. Sono state utilizzate le coppie ioniche idrofobe con sodio dodecilsolfato, oppure i complessi col polistirene sulfonato (nanoparticelle ibride lipidico-polimriche ¿ PLN); è stata utilizzata anche l'insulina glargine, a causa della sua diversa sequenza aminoacidica e solubilità. Il rilascio del farmaco in mezzo gastro-intestinale è stato modulato a seconda della tecnica di inglobamento utilizzata. Le SLN di acido stearico sono state paragonate i carrier lipidici nanostrutturati (NLC), costituiti da acido stearico/acido oleico. La bioattività dell'insulina inglobata è stata dimostrata attraverso esperimenti in vivo. Gli esperimenti ex vivo, condotti attraverso la tecnica dell'intestino legato, hanno mostrato un assorbimento maggiore delle NLC marcate rispetto alle SLN. Le NLC sono state quindi selezionate e caricate con insuline marcate con fluorofori, che erano state precedentemente sintetizzate e caratterizzate: gli esperimenti con l'intestino legato hanno mostrato un promettente assorbimento intestinale dell'insulina marcata da queste formulazioni. In studi futuri, sarà studiato l'assorbimento in vivo, seguendo un approccio farmacocinetico ed utilizzando ratti sani, a cui verranno somministrate nanoparticelle caricate con insuline marcate. Il ruolo del sistema linfatico intestinale verrò indagato attraverso tramite cannulazione del dotto toracico di ratti sani. I test di responsività glicemica verranno effettuati in un secondo momento, perché strettamente dipendenti dal modello animale utilizzato (sano o diabetico) e sulla cinetica di assorbimento dell'insulina. Bibliografia 1. Powers M.E.; Matsuura J.; Brassell J. et al. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. Biopolymers, 1993, 33, 927¿932. 2. Gallarate, M.; Battaglia, L.; Peira, E. et al. Peptide-loaded solid lipid nanoparticles prepared through coacervation technique 2011. International Journal of Chemical Engineering doi:10.1155/2011/132435.