Caratterizzazione chimica del metaboloma urinario in pazienti affetti da diabete di tipo 2

Metabolomics is defined as the systemic study of metabolite profiles, their qualitative and quantitative distribution, and their dynamics as a result of genetic modifications, physiological, environmental and nutritional stimuli. In this perspective, metabolomics can be considered an efficient approach in detecting potential biomarkers of metabolic perturbations at an early stage [1]. The analytical approaches commonly used in metabolomic studies include: Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Liquid Chromatography coupled with Mass spectrometry (LC-MS), Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) and Direct-infusion MS. The choice of which technique to use depends on metabolites' physicochemical properties and sample type (biofluids, tissue extracts, etc). The present thesis has been focused on the development of GC analytical methods suitable for qualitative and quantitative profiling of the human urine metabolome with a focus on low-molecular weight analytes belonging to different classes. GC-MS and Two-Dimensional Comprehensive GC-MS (GC×GC-MS) have been used for metabolite profiling (aminoacids, monosaccharides and organic acids above all) in urine samples from humans affected by type-2 diabetes. In the first part of this study, 23 metabolites, chosen because of their capability to provide information about the examinated disease, have been analized and quantified by GC-MS. In particular: piruvic acid, lactic acid, alanine, malonic acid, valine, leucine, glycerol, proline, glycine, succinic acid, threonine, malic acid, creatinine, α-ketoglutaric acid, phenylalanine, xylitol, ribitol, fructose, galactose, glucose, tyrosine, mannitol and myo-inositol have been selected and monitored in about 80 urine samples. GC×2GC-MS/FID has been used in a later stage of the study for a more detailed profiling of all the detectable metabolites; this investigation has been accompanied by a dedicated data elaboration approach (untargeted analysis) and results interpreted by chemometrics. Unsupervised multivariate analysis - PCA (Principal Component Analysis) - allowed to combine quantification and profiling results (from GC-MS and GC×GC-MS, respectively) and to identify discriminating markers between two groups.

La metabolomica è lo studio sistematico dei metaboliti in un sistema biologico, la loro distribuzione quali-quantitativa, e delle loro dinamiche, che sono l'espressione del genotipo, rispondono a stimoli fisiologici, fattori ambientali, nutrizionali,ecc. Per questo motivo la metabolomica è considerata un approccio efficace all'individuazione di potenziali indicatori (biomarker) di perturbazioni metaboliche anche in uno stadio molto precoce [1]. Nell'ambito degli studi di metabolomica vengono utilizzate diverse piattaforme analitiche, tra cui Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS), Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) e Direct-infusion MS, in funzione dei metaboliti di interesse e delle loro caratteristiche chimico-fisiche, oltre che alla tipologia di campione in esame (fluidi biologici, tessuti ecc.). Questo lavoro di tesi si è focalizzato sulla messa a punto di un metodo di analisi dettagliata (profiling quali e quantitativo) del metaboloma urinario umano. In particolare, lo studio si è rivolto alla caratterizzazione del profilo di metaboliti a basso peso molecolare (aminoacidi, monosaccaridi, acidi organici, ecc.) in urine umane, appartenenti a pazienti affetti da diabete di tipo 2, attraverso l'utilizzo di piattaforme analitiche basate sulla separazione gas cromatografica mono e bidimensionale accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS e GC×GC-MS). I metaboliti su cui si è focalizzata una prima fase dello studio sono stati selezionati sulla base del potenziale informativo riferito alla patologia in esame; in particolare si sono analizzati: acido piruvico, acido lattico, alanina, acido malonico, valina, leucina, glicerolo, prolina, glicina, acido succinico, treonina, acido malico, creatinina, acido α chetoglutarico, fenilalanina, xilitolo, ribitolo, fruttosio, galattosio, glucosio, tirosina, mannitolo e mio-inositolo. Tali composti sono stati inoltre quantificati mediante standardizzazione esterna sulla piattaforma GC-MS. La GC×2GC-MS/FID è stata utilizzata in una fase successiva per uno screening dettagliato (profiling) di tutti i metaboliti rilevabili, approfondendo gli aspetti riguardanti l'elaborazione dei dati cromatografici e la loro interpretazione ai fini dello studio. L'analisi multivariata non supervisionata PCA (Principal Component Analysis) e supervisionata AFD (Analisi Fattoriale Discriminante) ha infine permesso di abbinare i risultati di quantificazione ottenuti sui marker selezionati ed i risultati del profiling mediante GC×2GC-MS/FID, e individuare marker discriminanti tra i gruppi di pazienti.