Drug Design studiato tramite la cristallografia di proteine

The Cdc25 phosphatases are key enzymes in the regulation of the eukaryotic cell cycle. They are dual specificity phosphatases which are able to remove phosphates from two inhibitory phosphorylation sites in their cyclin dependent kinase (Cdk) substrates, which then act to drive the progression of the cell cycle. Overexpression of the Cdc25 phosphatases has been correlated to a diverse range of aggressive cancers, making them promising novel targets for the development of anticancer therapeutics. The only site on the Cdc25 phosphatase which has so far been targeted for inhibitor development has been the active site. A quinone-based inhibitor, well studied by J. Liu1, is object of study in this work in order to confirm the binding of with Cdc25A through structural methods in particular with X-ray crystallography. Despite considerable attention in the literature, the active site direct approach has not been particularly productive. Recent work has indicated that the interaction between Cdc25 phosphatases and their Cdk substrates is mediated by only a few 'hotspot' residues. A large pocket adjacent to these residues has been suggested as a potential site for disruption of the Cdc25-Cdk protein-protein interaction by a small molecule inhibitor. A new technique (KTGT2) has been developed to find inhibitors of protein-protein interactions in a site directed manner, such that this can eventually applied to the Cdc25-Cdk system. Work herein describes the investigation of the binding of the template protein with some small molecule inhibitors to attempt to validate further this new screening methodology.

Le Cdc25 fosfatasi sono enzimi chiave nella regolazione del ciclo cellulare. Sono fosfatasi dalla doppia specificità, che possono rimuovere gruppi fosfati da due siti di fosforilazione sui loro substrati, le cicline chinasi dipendenti (Cdk), le quali hanno un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare. La sovraespressione delle tre isoforme conosciute delle Cdc25 fosfatasi (A, B e C) è stata correlata a diversi tipi di cancro, rendendole un nuovo e promettente target per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Finora solo il sito attivo delle Cdc25 fosfatasi è stato sfruttato come bersaglio per lo sviluppo di inibitori. La prima parte di questo studio si concentra su un inibitore a struttura chinonica, studiato da J. Liu1. In particolare si cerca una conferma del diretto legame di questo composto con il sito attivo della Cdc25A tramite metodi strutturistici come la cristallografia di proteine. E' stata determinata solo la struttura del cristallo della proteina senza l'inibitore con una risoluzione di 3.0 Å. Nonostante il cospicuo lavoro trovato in letteratura, l'approccio che studia il legame diretto con il sito attivo non è stato molto produttivo. Un recente lavoro ha indicato che alcuni residui 'hotspot' mediano l'interazione tra le Cdc25 fosfatasi e il loro substrato Cdk. Si suggerisce che una spaziosa tasca adiacente a questi residui possa essere un potenziale sito per inibitori che interrompano l'interazione delle Cdc25 con le Cdk. E' stata sviluppata na nuova tecnica (KTGT2) per trovare inibitori diretti al suddetto sito, che usa un'altra proteina come modello (TS), e si pensa che potrebbe essere applicata al sistema Cdc25-Cdk. Il seguente lavoro presenta una evidenza del diretto legame di TS con un ligando di piccola dimensione, cercando di rendere valida questa nuova metodolgia di screening. La convalida della tecnica KTGT, usando TS come modello, permette di applicarla anche al sistema delle Cdc25 fosfatasi con il fine di trovare nuovi ligandi.