Purificazione del 4-metilzimosterone ottenuto da un ceppo di lievito ingegnerizzato privo dell'attività 3-chetosteroide reduttasica

La proteina codificata dal gene HSD17B7 annovera tra le sue funzioni l'attività 3-chetoreduttasica nei confronti del 4-metilzimosterone. Questo intermedio della fase postsqualenica del metabolismo del colesterolo, da recenti studi, sembra risultare tossico per le proteine Hedgehog, le quali hanno un ruolo determinante per il corretto sviluppo embrionale e nella proliferazione delle cellule staminali nell'adulto [1]. Non essendo presente in commercio il 4-metilzimosterone, è stato studiato un protocollo per la sua produzione a partire dai ceppi di lievito ingegnerizzati K206A e R40A, esprimenti una versione mutata della proteina 3-chetoreduttasi (Erg27p), ortologa dell'enzima Hsd17b7p umano. Nel lievito, questa proteina ha un'azione protettiva nei confronti dell'enzima ossidosqualene ciclasi: i ceppi knock out per la 3-chetoreduttasi accumulano ossidosqualene come se fossero privi dell'enzima ossidosqualene ciclasi. Nei ceppi K206A e R40A citati, invece, l'attività protettiva è mantenuta mentre risulta compromessa quella catalitica: in essi, pertanto, si accumulano 3-chetosteroidi [2]. In una prima fase del lavoro è stata saggiata l'attività metabolica postsqualenica dei due ceppi K206A e R40A, tramite l'incorporazione di acetato di sodio marcato in cellule proliferanti; nell'estratto insaponificabile di entrambi i ceppi la radioattività risulta prevalentemente associata alla frazione 4-metil-3-chetosteroide. Si è proceduto quindi alla coltura su larga scala dei due ceppi e gli estratti insaponificabili sono stati sottoposti a cicli di purificazione mediante flash cromatografia, TLC Preparativa e TLC con AgNO3; per quest'ultima applicazione preparativa si è tentato di trasporre su colonna il metodo cromatografico su strato sottile, senza però riuscire ad ottenere una significativa separazione dei componenti della miscela. Si è continuato pertanto a sfruttare il protocollo sviluppato su TLC. Si è valutata la purezza dei composti ottenuti con IC-MS e GC-MS, ricavando dati positivi riguardo la presenza d'impurezze, di cui è stata determinata la struttura e l'abbondanza relativa all'interno della frazione estratta. A seguito di questa consistente produzione di 4-metilzimosterone sono ora in corso studi di stabilità e sono state avviate prove biologiche di proliferazione cellulare, di citotossicità, soprattutto su cellule esprimenti il sistema di segnalazione delle Hedgehog proteins, al fine di verificare l'effettivo meccanismo d'azione del 4-metilzimosterone. Sarà interessante, nel prossimo futuro, identificare le cosiddette ¿impurezze¿ del 4-metilzimosterone, separabili solo su TLC con AgNO3. Una di queste, infatti, ha abbondanza relativa confrontabile con quella del 4-metilzimosterone. [1] R. W. Stottmann, A. Turbe-Doan, P. Train, L. E. Kratz, J. L. Moran, R. I. Kelley, D. R. Beier (2011), Plos Gen. ; 7(9): 1-16 [2] B. Teske, S. Taramino, M. S. A. Bhuiyan, N. S. Kumaraswami, S. K. Randall, R. Barbuch, J. Eckstein, G. Balliano, M. Bard (2008), Biochim. Biophys. Acta; 1781: 359-366