L'assenza di una chiara comprensione degli effetti ambientali e sanitari degli organismi geneticamente modificati (OGM) ha generato accesi dibattiti pro e contro l'adozione di questa tecnologia applicata per scopi agronomici ed alimentari. Per tali ragioni, sin dai primi anni `90, l'Unione Europea ha cercato di definire una normativa sugli OGM impiegati nella produzione di alimenti che si è evoluta nel tempo e che stabilisce l'etichettatura obbligatoria per tutti quei prodotti alimentari, compresi i mangimi, che contengano più dello 0,9% di OGM per singolo ingrediente. A tal fine, è necessaria una rete di controlli organizzata da parte di diverse istituzioni comunitarie e nazionali e la disponibilità di tecniche che consentano di rilevare, identificare e quantificare in modo accurato e preciso la presenza di OGM negli alimenti e nei mangimi. Attualmente nei laboratori di diagnosi, la ricerca degli OGM in matrici agro-alimentari viene condotta con la metodica PCR end point. Tale metodica presenta alcune limitazioni che sono in parte superate nella metodica PCR Real-Time e ad oggi sono stati messi a punto, grazie al lavoro congiunto di alcuni laboratori europei coordinati dal Joint Research Centre, metodi PCR Real-Time per l'analisi qualitativa degli OGM. Tuttavia, un laboratorio, accreditato secondo le norme ISO 17025 per il controllo analitico degli OGM, deve dimostrare di essere in condizione di applicare il metodo e di garantire il rispetto delle qualità delle loro prestazioni attraverso l'allestimento di un piano di validazione, che consiste nella verifica di una serie di parametri che ne caratterizzano le funzioni. Lo scopo di questo lavoro consiste nella progettazione e nella realizzazione dei piani di validazione per la verifica delle metodiche PCR Real-Time applicate alla rilevazione qualitativa di DNA endogeno di mais (¿monitor PCR hmg¿), del promotore 35S e del terminatore NOS (nel rilevamento generico dei OGM), e alla determinazione della linea di mais MON810 (identificazione dell'OGM) in matrici agroalimentari. A tale scopo sono stati presi in considerazione i seguenti indici di prestazione: il limite di rivelazione (LOD), ossia la concentrazione più bassa di DNA bersaglio che il metodo è in grado di rilevare, la precisione, determinata come il grado di accordo fra risultati indipendenti ottenuti da due operatori diversi, la robustezza, valutata sottoponendo il metodo a variazioni della temperatura di annealing dei primers di  1°C e  2°C, la stabilità delle soluzioni dei primers e delle sonde utilizzate, l'accuratezza del metodo di discriminare i campioni negativi e positivi per il DNA bersaglio considerato e la linearità tra i risultati ottenuti e le copie genomiche del gene endogeno hmg presenti nel campione. I risultati ottenuti con questo lavoro possono essere considerati soddisfacenti nel garantire le prestazioni delle metodiche PCR Real-Time per la rilevazione qualitativa di DNA bersaglio sopracitato nella pratica ordinaria delle attività di controllo finalizzate alla ricerca di OGM in matrici agro-alimentari.

Ricerca di mais GM MON810 in matrici agroalimentari: validazione del metodo preliminare di screening e della ricerca qualitativa con PCR Real-Time

ROSSETTO GIACCHERINO, ROBERTA
2009/2010

Abstract

L'assenza di una chiara comprensione degli effetti ambientali e sanitari degli organismi geneticamente modificati (OGM) ha generato accesi dibattiti pro e contro l'adozione di questa tecnologia applicata per scopi agronomici ed alimentari. Per tali ragioni, sin dai primi anni `90, l'Unione Europea ha cercato di definire una normativa sugli OGM impiegati nella produzione di alimenti che si è evoluta nel tempo e che stabilisce l'etichettatura obbligatoria per tutti quei prodotti alimentari, compresi i mangimi, che contengano più dello 0,9% di OGM per singolo ingrediente. A tal fine, è necessaria una rete di controlli organizzata da parte di diverse istituzioni comunitarie e nazionali e la disponibilità di tecniche che consentano di rilevare, identificare e quantificare in modo accurato e preciso la presenza di OGM negli alimenti e nei mangimi. Attualmente nei laboratori di diagnosi, la ricerca degli OGM in matrici agro-alimentari viene condotta con la metodica PCR end point. Tale metodica presenta alcune limitazioni che sono in parte superate nella metodica PCR Real-Time e ad oggi sono stati messi a punto, grazie al lavoro congiunto di alcuni laboratori europei coordinati dal Joint Research Centre, metodi PCR Real-Time per l'analisi qualitativa degli OGM. Tuttavia, un laboratorio, accreditato secondo le norme ISO 17025 per il controllo analitico degli OGM, deve dimostrare di essere in condizione di applicare il metodo e di garantire il rispetto delle qualità delle loro prestazioni attraverso l'allestimento di un piano di validazione, che consiste nella verifica di una serie di parametri che ne caratterizzano le funzioni. Lo scopo di questo lavoro consiste nella progettazione e nella realizzazione dei piani di validazione per la verifica delle metodiche PCR Real-Time applicate alla rilevazione qualitativa di DNA endogeno di mais (¿monitor PCR hmg¿), del promotore 35S e del terminatore NOS (nel rilevamento generico dei OGM), e alla determinazione della linea di mais MON810 (identificazione dell'OGM) in matrici agroalimentari. A tale scopo sono stati presi in considerazione i seguenti indici di prestazione: il limite di rivelazione (LOD), ossia la concentrazione più bassa di DNA bersaglio che il metodo è in grado di rilevare, la precisione, determinata come il grado di accordo fra risultati indipendenti ottenuti da due operatori diversi, la robustezza, valutata sottoponendo il metodo a variazioni della temperatura di annealing dei primers di  1°C e  2°C, la stabilità delle soluzioni dei primers e delle sonde utilizzate, l'accuratezza del metodo di discriminare i campioni negativi e positivi per il DNA bersaglio considerato e la linearità tra i risultati ottenuti e le copie genomiche del gene endogeno hmg presenti nel campione. I risultati ottenuti con questo lavoro possono essere considerati soddisfacenti nel garantire le prestazioni delle metodiche PCR Real-Time per la rilevazione qualitativa di DNA bersaglio sopracitato nella pratica ordinaria delle attività di controllo finalizzate alla ricerca di OGM in matrici agro-alimentari.
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