Sinergismo e interazione tra Begomovirus e virus a RNA in Nicotiana benthamiana

Plants simultaneously infected by two viruses belonging to different species very often display symptoms that are far worse than the sum of the syptoms induced by the viruses when singly infected. Often the worsening of symptoms is parallel to a rise in the titre of one or both viruses. This kind of interaction among viruses, called synergism, can be of a symmetrical or of an asymmetrical type. Synergistic relations may occur between viruses which are closely related and between viruses that are not. It has been common knowledge for a number of years that viral proteins called posttranscriptional gene silencing (PTGS) suppressors have a key role in synergistic relations. PTGS is a metabolic pathway, common to all eukaryotic organisms, responsible for recognition and degradation of double-strand RNAs (dsRNAs). After the dsRNAs have been recognized and cut, their sequences are ¿memorized¿ by means of siRNAs, which are in turn used as templates to recognize and degrade all complementary RNAs present, not only in one cell but in the whole organism. During evolution, viruses have evolved a number of proteins which are able to counteract posttranscriptional gene silencing. These proteins are commonly known as silencing suppressors. Often the presence of two different suppressors can lead to synergism. In this thesis we have analyzed the variations in symptoms and viral titres in Nicotiana benthamiana plants co-infected by RNA viruses (CABMV and AMCV) encoding well-known silencing suppressors, and Begomoviruses (TYLCSV and AbMV). CABMV encodes the powerful HC-Pro suppressor protein, while AMCV encodes the p19 silencing suppressor protein. Begomoviruses activate PTGS reactions in plants even if their genome is made up by ssDNA, so they have developed proteins that are active silencing suppressors: C2, C4 and V2. These suppressors are far less characterized than HC-Pro or p19. We compared symptoms and viral titres of plants inoculated with single viruses against plants inoculated with combinations of two viruses. The CABMV/AbMV combination caused very severe symptoms and enhanced titres of both viruses, leading to the only truly mutualistic and symmetric synergism observed during this experiment. The CABMV/TYLCSV combination led to an enhancement only in the titres of TYLCSV (which was never observed in past experiments) and a simultaneous worsening of leaf symptoms typical of CABMV at 45 d.p.a.i., not observed in the CABMV/AbMV combination. AMCV, on the other side, did not establish synergistic relations with the two Begomoviruses, as none of the viral titres showed significant variations between single and double infections. Instead, Begomoviruses seemed to act antagonistically against AMCV, leading to the amelioration of symptoms typically caused by AMCV during late stages of infection (45 d.p.a.i.). So we can conclude that in this experiment HC-Pro carried out its silencing suppression role, and was made more efficient by the presence of begomoviral proteins, while p19 didn't. Co-inoculation of the two Begomoviruses shows an enhance in AbMV titre and a reduction of TYLCSV titre compared to single infections. This is interesting novel data that will hopefully lead to future investigations on the role of V2 protein in these interactions. Furthermore, it would be interesting to better understand the specific interactions taking place between suppressors encoded by Begomoviruses and well-known suppressors encoded by RNA viruses.

Sovente l'infezione contemporanea di una pianta da parte di due virus di specie diverse porta alla manifestazione di sintomi molto più gravi della somma dei sintomi causati da infezione dai singoli virus. Questo tipo di interazione tra virus è detto sinergismo, che può essere mutualistico (o simmetrico) o unidirezionale (o asimmetrico). Relazioni sinergiche si instaurano sia tra virus filogeneticamente vicini che lontani. E' noto da tempo che nell'instaurarsi di relazioni sinergiche tra virus un ruolo fondamentale è svolto dalle proteine virali dette soppressori di silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS). Il PTGS è un meccanismo endogeno comune a tutti gli eucarioti che porta al riconoscimento e alla degradazione degli RNA a doppio filamento, le cui sequenze vengono ¿memorizzate¿ (sotto forma di siRNA) e usate come stampo per il riconoscimento e la ulteriore degradazione di tutti gli RNA uguali o complementari ad essi in tutto l'organismo. Naturalmente i virus vegetali hanno sviluppato numerose proteine per contrastare il PTGS, dette soppressori del silenziamento genico. Spesso la contemporanea azione di più soppressori porta a infezioni aggravate, con sintomi esacerbati e titoli virali aumentati. In questa tesi sono state valutate le variazioni in sintomi e titoli virali di piante con infezioni miste tra virus a RNA (CABMV e AMCV) codificanti noti soppressori di silenziamento genico e Begomovirus (AbMV e TYLCSV), in Nicotiana benthamiana. CABMV codifica il potente soppressore di silenziamento HC-Pro, mentre AMCV codifica il soppressore di silenziamento p19. I Begomovirus, nonostante abbiano genoma a DNA a singolo filamento, attivano i meccanismi di PTGS, e hanno sviluppato proteine con funzione di soppressione di silenziamento, ovvero C2 e C4 (comuni ad AbMV e TYLCSV) e V2 (codificata solo da TYLCSV). Si sono comparati sintomatologia e titoli virali delle piante inoculate con singoli virus rispetto a quelle con infezioni miste. L'infezione mista con questi due virus ha causato sintomi gravissimi e un aumento nei titoli di entrambi i virus, generando l'unico sinergismo veramente mutualistico osservato in questo esperimento. La combinazione CABMV/TYLCSV ha portato ad una aumento solo del titolo di TYLCSV, ma ad un aggravamento dei sintomi fogliari tipici di CABMV, non osservato per la combinazione CABMV/AbMV. AMCV, invece, non ha instaurato rapporti sinergici con i Begomovirus, come dimostra l'assenza di variazione sia nei titoli di AbMV e TYLCSV che in quelli di AMCV. Al contrario, i Begomovirus sembrano aver svolto azione antagonistica nei confronti di AMCV, portando a un miglioramento dei sintomi tipici del virus a RNA in fase tardiva d'infezione. Pare dunque che la proteina HC-Pro abbia svolto efficientemente il suo ruolo di soppressione e sia stata potenziata dalla presenza di prodotti genici dei Begomovirus, mentre la proteina p19 non abbia svolto efficacemente il suo ruolo in presenza di questi ultimi. Sono interessanti, infine, i risultati ottenuti dalla combinazione AbMV/TYLCSV, che mostrano un aumento di AbMV e una diminuzione di TYLCSV rispetto alle infezioni con i singoli virus. Fattore cruciale nell'aumento di AbMV potrebbe essere la presenza della proteina V2. Sono comunque necessari ulteriori accertamenti sia sull'interazione tra questi due virus e il ruolo della proteina V2 in questa interazione, che sull'interazione tra i loro soppressori di silenziamento e i più conosciuti soppressori dei virus a RNA.