Il recettore FPR2/ALX: un nuovo meccanismo di regolazione funzionale dei polimorfonucleati

Inflammation is a protective response issued by the organism to remove injurious stimuli as well as initiate the healing process. When unregulated, however, it is also the key of tissue damage and injury. This is the paradox of the inflammation: it is an essential process for the well-being and survival of the organism but also it can trigger tissue injury. 37,38 For this reason current studies keep focusing on leukocytes chemotaxis, ligands and receptors involved in this process. With a comprehensive molecular understanding of the structure-function relationships of chemotactic activation, intervention that mitigates injury but enhances microbial killing may become possible. 39,15,16 This project focuses on the analysis of the expression and function of the FPR2/ALX, an important G Protein coupled receptor belonging to formyl peptide (FPR) receptor family. Our current hypothesis is that the FPR2/ALX receptor is a key anti-inflammatory receptor responsible for endogenous homeostatic signaling, which modulates the host response and pro-resolving actions. The aims of the project are the identification of differential binding sites for FPR2/ALX ligands and the definition of AnxA1 receptor-mediated responses. We have been investigating on the FPR2/ALX region(s) required for AnxA1 binding and for AnxA1-elicited responses by looking at the sequences required for the binding of AnxA1 and other FPR2 agonists such as SAA, Antiflammin 2 (AF2) and C43. Furthermore, we are studying whether or not FPR2/ALX receptor could be desensitized upon ligands binding. HEK cells and neutrophils have been analyzed in the absence or presence of drug treatment, and then they have been used to determine specific read-outs of cell activation. Predominantly the Novostar¿ from BMG was mastered to quantify changes in intracellular calcium. HEK-293 FPR2/ALX transfected cells responded to the agonists with mobilization of intracellular calcium in a fashion similar to what we observed in neutrophils. To compare the ligand-binding site required for AnxA1, SAA, C43 and AF2, ligand-induced calcium mobilization was also observed in HEK-293 Chimaeric receptors constituted with different parts of FPR1 and FPR2 receptors. We also used Western blotting analysis to monitor ERK phosphorylation and, the use of FACS analysis was also performed to determinate Chimaeric receptors' affinity for the FPR1 and FPR2 antibody. In summary, we have used a chimaeric approach and the analysis of 8 chimeras between FPR1 and FPR2 receptors have led to the identification of the domains responsible for selective binding of FPR2 agonists and G protein activation. The data obtained suggests that AnxA1 requires the N-terminus for the phosphorylation and the interaction with the II and the III extracellular loops are important for the desensitization (diminution of 40% of calcium mobilization). SAA requires the I and the II extracellular loops to activate the receptor and the C43 requires the I extracellular loop to develop full agonism. For AF2 the three extracellular loops appear to be important in the signalling induced by this ligand (40% of calcium mobilization) and for fMLP the substitution of any portion of the FPR1 reduces the effectiveness of the agonist. On the basis of our recent studies we also think that the FPR2/ALX receptor is significantly desensitized (p<0.05) after 5 min. of pre-treatment with AnxA1 10nM, SAA 0.1 µM, C43 1 µM and AF2 3 µM either on an omologus or eterologus way.

L'infiammazione è un processo essenziale per il benessere quotidiano e la sopravvivenza dell'organismo ma allo stesso tempo può attivare un danno tissutale. Lo studio dei processi biochimici che stanno alla base dell'attivazione della chemiotassi può contribuire a identificare nuovi approcci in grado di ridurre il danno tissutale senza interferire con i processi messi in atto per eliminare l'agente dannoso. Per questo motivo lo scopo della Tesi è analizzare l'espressione e la funzione del recettore FPR2/ALX, che rappresenta l'isoforma della famiglia dei recettori per peptidi formilati (FPR) maggiormente coinvolta nei processi chemiotattici. Nello specifico, sono stati studiati i differenti siti di legame del recettore FPR2/ALX con i suoi ligandi selettivi, AnxA1, SAA, C43 e AF2. La conseguente attivazione recettoriale è stata evidenziata mediante esperimenti di mobilizzazione di calcio intracellulare utilizzando uno specifico fluorimetro (Novostar¿ BMG). Cellule HEK-293 (Human Embryonic Kidney) e neutrofili umani sono state utilizzate per determinare l'attivazione cellulare in assenza e presenza dei trattamenti farmacologici in studio. Per paragonare i siti di legame richiesti dagli agonisti FPR2/ALX , AnxA1, SAA, C43 e AF2, la mobilizzazione del calcio indotta dal legame con il recettore è stata anche studiata in cellule HEK-293 trasfettate con recettori chimerici costituiti da parti dei recettori FPR1 e FPR2/ALX. Mediante la tecnica del Western blotting è stato possibile monitorare la fosforilazione ERK indotta dall'attivazione recettoriale. L'utilizzo della tecnica del citofluorimetro ha permesso di determinare l'affinità dei recettori chimerici per gli anticorpi FPR1 e FPR2. I dati ottenuti dimostrano che AnxA1 richiede la regione N-terminale per attivare una fosforilazione cellulare. Le interazioni con il II e il III loops extracellulare sono invece importanti per la desensitizzazione recettoriale (diminuzione del 40% della mobilizzazione del calcio). SAA richiede il I e il II loop extracellulare per legarsi al recettore. Il legame di C43 con il I loop extracellulare porta ad una azione agonista addirittura superiore a quella ottenuta in seguito al legame con l'intero recettore FPR2/ALX (mobilizzazione del calcio intracellulare dell' 85% vs 60% ottenuta con il legame con FPR2/ALX). Per quanto riguarda AF2, tutti tre i loops extracellulari sono importanti nell'indurre l'attivazione recettoriale. Ulteriori esperimenti hanno permesso di dimostrare che il recettore FPR2/ALX può significativamente essere desensibilizzato in modo omologo ed eterologo, dopo 5 minuti di pre-trattamento con AnxA1 (10nM), SAA (0.1 µM), C43 (1 µM) e AF2 (3 µM). Nell'insieme i risultati offrono importanti informazioni sulle caratteristiche strutturali e funzionali dei recettori FPR2/ALX.