MECCANISMI DI TOSSICITA' DEL CADMIO SULLA LINEA CELLULARE DI NEUROBLASTOMA UMANO SH-SY5Y

Cadmium (Cd2+)is an heavy metal more toxic for many animal and vegetal organisms. It extends to accumulate in different organs, as lung, kidney, liver and bones and originating acute and chronic infiammations. Besides, Cd2+ is classified from IARC as a carcinogenic element type 1 for human, it's able to produce cancer in lung, kidney, prostate e maybe in breast. Many studies hypothesized that Cd2+ expound its toxicity through many molecular mechanisms changing Calcium (Ca2+) homeostasis, damaging anti-toxic enzymatic system and enhancing oxygen reactive species (ROS). Because different environmental pollutants inducing ROS, like Rotenone (a pesticide), are suspected to have a role in etiopathogenesis of neurodegenerative disease, many studies indicate that cadmium could exercise a neurotoxic effect through analogue mechanism. In this study we have analyze neurotoxic effects of Cd2+ in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Firstly we valuate cell viability and the results indicate a strong relationship dose-effect and time-dependence with a μM concentrations. In the next step, we showed, through atomic adsorption spectroscopy to determinate intracellular Cd2 concentration, that metal is able to introduces in cells and probably the effects describe before are directly dependent from metal toxicity. Then we analyze the Cd2+ ability to produce ROS, utilizing a ROS marker (2',7', Diclorofluorescein), we showed that Cd2+ is able to produce oxidative stress (only detectable at 24 hours). The antioxidant's addiction (NAC, N-AcetylCysteine) reduce the citotoxic effect of cadmium and this confirm the ROS play a key role to induce death cell. The ROS intracellular increase induced by cadmium is not link to Fenton's reaction and in a minor activity of antioxidants enzymes, SOD and catalase. The cells are able to produce metallothionein 1, a protein that's able to bind the metal and to have an antioxidant action. ROS are famous to induce apoptosis, then we confirmed, through citofluorimetry test, that cadmium causes death cell with apoptotic mechanisms. In the second part of the experiment we valuated if Cd2+ was a metal able to interact with the receptorial system of PPAR-γ. These PPAR-γ receptors are transcriptional factors with a zinc fingers domains, that are able to regulate different process as apoptosis, differentiation and cell development. It's also able to protect from oxidative stress. Ours details showed that Cd2+ reduce strongly the PPAR-γ expression and the PPAR-γ protein. The hypothesis was that the reduction of PPAR-γ can represented an important way to determine citotoxicity. A partial acknowledgement is coming from the next experiment that showed a minor citotoxicity and apoptosis by cadmium in presence of prostraglandin J2, endogenous ligand of PPAR-γ receptors. Further studies are necessary to know if exist an interaction between the ROS increase and the PPAR-γ reduction or if this two mechanisms are independent in death cell.

Il cadmio (Cd) è un metallo pesante fortemente tossico per la maggior parte degli organismi animali e vegetali e tende ad accumularsi in diversi organi provocando infiammazioni acute e croniche. Il Cd2+ è classificato dalla IARC come cancerogeno di tipo I per l'uomo. Probabilmente il Cd2+ esercita la sua tossicità attraverso molteplici meccanismi, modificando l'omeostasi del Ca2+, danneggiando sistemi enzimatici endocellulari antiossidanti e inducendo proteine chelanti. Alcune delle sue azioni biologiche sembrano legate ad un aumento delle specie reattive dell'O2 e all'alterazione dei sistemi di riparazione del DNA e di induzione di apoptosi. Poichè diversi inquinanti ambientali produttori di ROS sono considerati sostanze in grado di indurre specifiche forme di malattie neurodegenerative, è plausibile l'ipotesi che anche il Cd2+ possa esercitare un effetto neurotossico attraverso un meccanismo analogo. In quest'ottica abbiamo valutato gli effetti neurotossici del Cd2+ sulla linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Inizialmente è stata valutata la vitalità cellulare come indice di tossicità e i risultati dimostrano una chiara relazione dose-effetto e tempo-dipendenza, in un range di concentrazioni micromolari. Successivamente, utilizzando la spettroscopia ad assorbimento atomico, abbiamo determinato la cinetica intracellulare ed extracellulare del Cd2+ osservando un significativo assorbimento del metallo già a 4 ore. In seguito, utilizzando il test della diclorofluoresceina sia al citofluorimetro che al microscopio a fluorescenza, è stato misurata la capacità del Cd2+ di produrre ROS e si è notato un leggero aumento di stress ossidativo esclusivamente a 24h. Inoltre, l'aggiunta di un antiossidante (N-acetil-cisteina, NAC) hanno dimostrato un significativo effetto protettivo della NAC alla sola concentrazione di 10 mM. Negli esperimenti successivi sono stati analizzati i meccanismi di morte; utilizzando tecniche citofluorimetriche, si è osservato che il Cd2+ portava ad attivazione di processi apoptotici piuttosto che di necrosi. Per evidenziare i meccanismi di azione del Cd2+ abbiamo valutato l'espressione di alcuni geni implicati nella risposta antiossidante, come la superossido dismutasi 1 e la catalasi, non osservando un aumento. Stessa cosa abbiamo fatto per la metallotioneina 1, proteina che lega i metalli pesanti a scopo detossificante, in cui abbiamo osservato un aumento significativo in relazione al tempo di contatto con il Cd2+ e per il fattore di trascrizione metallo correlato, ma in questo caso non risulta esserci espressione di mRNA.A questo punto, poichè il Cd è un metallo in grado di interferire con processi cellulari mediati da proteine contenenti domini ¿Zinc finger¿, quali i recettori per gli estrogeni, è stato ritenuto interessante studiare una possibile interazione del Cd ed i recettori PPAR-γ e si è osservato sia a livello genico che proteico una diminuzione a 24h. A conferma di ciò siamo andati a valutare l'effetto dell'interazione del cadmio con ligando endogeno (prostaglandina J2) notando una protezione nei confronti del Cd2+. Ciò potrebbe presupporre un effetto apoptotico del Cd2+, PPAR-γ dipendente nelle cellule SH-SY5Y. In conclusione, questo studio dimostra che il Cd è in grado di ridurre la vitalità di cellule di derivazione neuronale, attivando processi di necrosi e apoptosi, mediata dai fattori di trascrizione PPAR-γ e indipendente dalla formazione di ROS.