PKA media il rilascio di monossido di azoto ed i segnali di Ca2+ indotti da AA in cellule endoteliali di origine tumorale

L'angiogenesi costituisce un processo fondamentale per la crescita tumorale, e per tale motivo rappresenta quindi un importante bersaglio nella strategia terapeutica. Diversi lavori hanno dimostrato il ruolo chiave svolto dal Ca2+ nelle fasi iniziali e nella progressione della neovascolarizzazione. Durante il processo di angiogenesi, la formazione di nuovi vasi da quelli preesistenti, le cellule endoteliali (EC) vanno incontro ad una serie di modificazioni morfofunzionali ordinate nel tempo. In una prima fase le ECs proliferano, lasciano la lamina basale su cui aderiscono, migrano nella matrice del tessuto circostante, ed infine si riorganizzano in nuove strutture `tubulari'. Questa sequenza di eventi è strettamente controllata da numerosi fattori di diversa natura e provenienza. Sono stati identificati fattori solubili prodotti da tipi cellulari diversi, incluse le ECs stesse: i principali e meglio conosciuti sono peptidi, come i VEGFs e gli FGFs, che interagiscono con recettori di membrana della famiglia delle tirosina cinasi. Inoltre, fra i segnali intracellulari innescati dalla stimolazione di una cellula normale da parte di un mitogeno, le variazioni della concentrazione del calcio citosolico libero, [Ca2+]i, occupano, in moltissimi casi, un ruolo determinante. Negli ultimi anni il nostro gruppo ha fornito alcuni contributi volti ad una migliore definizione dei meccanismi molecolari che stanno alla base dei segnali di calcio attivati da mitogeni nelle ECs. Abbiamo dimostrato che il metabolismo dell'acido arachidonico (AA), uno dei principali messaggeri intracellulari rilasciato in seguito a stimoli pro?angiogenici, e del monoossido di azoto (NO) svolgono un ruolo significativo nella regolazione dell'angiogenesi ed i suoi effetti sono strettamente correlati all'omeostasi del calcio ed alla proliferazione cellulare. L'ingresso di Ca2+ indotto da AA è inoltre coinvolto nelle prime fasi dell'angiogenesi tumorale, in particolare nella proliferazione cellulare e nella tubulogenesi, mentre risulta ¿downregolato¿ durante la riorganizzazione delle cellule endoteliali in strutture simili a capillari. L'obiettivo della tesi e' lo studio dei meccanismi alla base del controllo dell'angiogenesi tumorale in cellule endoteliali umane di microcircolo dissociate e purificate da carcinoma mammario. Negli ultimi anni il nostro gruppo ha proposto un modello di trasduzione del segnale intracellulare responsabile della regolazione dei canali proangiogenici in una linea di cellule endoteliali aortiche bovine (BAECs, vedi stato dell'arte); tale modello suggerisce l'intervento di due messaggeri intracellulari fondamentali per la fisiologia vascolare: l'acido arachidonico (AA) ed il monossido di azoto (NO). Mediante l'analisi di western blot di estratti proteici derivati da cellule BTEC stimolate con AA, ho dimostrato che questo fattore pro?angiogenico favorisce la fosforilazione, e quindi l'attivazione della ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), determinando un aumento della [NO] intracellulare, che siamo riusciti a mettere in evidenza grazie ad un setup di imaging dell'NO con la sonda DAR. Probabilmente la via di fosforilazione della eNOS in PeNOS passa dalla fosfochinasi A (PKA), dato che il trattamento con un inibitore della PKA (PKI) è in grado di bloccarne la fosforilazione. Una miglior definizione di questa via di trasduzione consentirà di individuare nuovi potenziali bersagli contro il processo di neovascolarizzazione tumorale.