Una nuova ubiquitina ligasi coinvolta nel controllo del cAMP in Dictyostelium.

La trasduzione del segnale intracellulare importante per le funzioni vitali di organismi uni- o pluricellulari. Alcune vie attivano una serie di effettori, fra cui l'adenilato ciclasi (AC), attraverso recettori associati a proteine G eterotrimeriche; altre sfruttano il sistema di ubiquitinazione, non più solo dedicato alla marcatura di proteine per la degradazione nel proteasoma. Il Dictyostelium discoideum è un'ameba sociale eucariotica che vive allo stato solitario in ambienti marcescenti ricchi di batteri. In esso i recettori associati alla proteina G e l'AC, quale enzima che sintetizza cAMP, giocano un ruolo cruciale nello sviluppo pluricellulare a 4-5 ore dalla privazione del cibo, in seguito ad aggregazione mediata dal cAMP. Il Dictyostelium è un ottimo modello di studio grazie al particolare sviluppo, alla manipolabilità rispetto ad altri organismi e alla sua genetica molecolare molto sviluppata. La generazione di mutanti knockout o iperesprimenti in maniera stabile un determinato gene è relativamente facile; sono diversi i saggi biochimici e di biologia cellulare per la loro caratterizzazione. Pia è un fattore citosolico essenziale per l'attivazione dell'AC, quindi per l'aggregazione, in Dictyostelium. Mutanti in cui il gene pia è interrotto per inserzione della resistenza all'antibiotico blasticidina, non aggregano, così come mutanti termosensibili (HSB1) a temperature non permissive. In entrambi i casi non c'è aggregazione né produzione di segnali di cAMP: l'AC non è attivabile, ma le cellule percepiscono e rispondono a segnali esogeni. Nel lavoro vogliamo individuare vie di trasduzione parallele o interconnesse con Pia nell'attivazione dell'AC. Abbiamo dunque applicato un approccio di genetica di soppressione nel mutante HSB1 per trovare mutanti in cui il fenotipo sia riscattato parzialmente o totalmente. Il razionale per una genetica di soppressione è che la regolazione di enzimi chiave, come l'AC, sia soggetta a più vie di trasduzione parallele e/o interconnesse, di tipo stimolatorio o inibitorio, per rendere il sistema più integrato e robusto. La soppressione di un secondo gene in un mutante può riscattare il fenotipo parentale, se il secondo gene è coinvolto in una via di trasduzione almeno parzialmente antagonista alla prima. Abbiamo scelto di trasformare il mutante HSB1 con un plasmide contenente la resistenza alla blasticidina. Tramite l'utilizzo di un enzima di restrizione elettroporato con il plasmide, si facilita l'integrazione del plasmide linearizzato in punti diversi del genoma caratterizzati dalla presenza del sito di restrizione dell'enzima. La generazione di un numero sufficientemente alto di mutanti da coprire l'intero genoma e la loro successiva analisi può portare all'identificazione di geni, la cui disattivazione ha permesso il riscatto del mutante di partenza. Il recupero del plasmide inserito nei mutanti riscattati con un enzima diverso da quello usato per la trasfezione ci permette di isolare anche le regioni fiancheggianti, quelle interrotte dall'integrazione del plasmide. Il loro sequenziamento ci permette di risalire al gene disattivato. Dei quattro mutanti identificati due hanno riscatto totale del fenotipo e lo stesso gene disattivato, codificante una nuova ubiquitina ligasi di tipo HECT: esso potrebbe avere ruolo chiave nella regolazione dei livelli di cAMP in Dictyostelium. Tale proteina presenta buon grado di omologia con membri della famiglia di ubiquitina ligasi Herc nei mammiferi. In Dictyostelium il knockout specifico dell'ubiquitina ligasi in questione porta a ritardo nell'aggregazione e nel raggiungimento dello stadio di mounds, ma precoce terminazione del normale sviluppo.