Studio di un metodo di produzione della proteina Ig-pCons per la terapia del Lupus Eritematoso Sistemico

Il Lupus Eritematoso Sistemico (LES) è una patologia autoimmune sistemica dovuta alla mancata tolleranza verso costituenti autologhi dell'organismo, il cui effetto è un danno diffuso ad organi e apparati. Attualmente non esistono terapie risolutive in grado di riportare allo stato di tolleranza il sistema immunitario. Studi condotti dal nostro gruppo di ricerca, hanno portato allo sviluppo di una terapia genica somatica in cui vengono inoculate, in un modello di topi del lupus, cellule B murine trasfettate con plasmide codificante la proteina Ig-pCons: proteina costituita dal peptide con funzione tollerogenica (pCons), e dalla porzione costante dell'immunologlobulina G1 umana. Il costrutto genico è risultato essere efficace nell'indurre tolleranza e nel proteggere dallo sviluppo del LES murino. Tuttavia, l'applicazione all'uomo di questa terapia, riscontra limiti tecnici ed implica il coinvolgimento di istanze di tipo etico. Oggetto di questa tesi è stato lo studio di un metodo di produzione della proteina Ig-pCons, per un futuro approccio terapeutico che privilegia la somministrazione della proteina alla terapia genica somatica nel trattamento del LES. Per la produzione della proteina Ig- pCons è stato scelto un sistema di espressione in cellule di mammifero: le cellule embrionali di rene umano 293 (HEK293). Le cellule HEK293 sono state trasfettate transientemente con plasmide codificante Ig-pCons contenente la sequenza per la secrezione della proteina all'esterno della cellula. Le cellule HEK293 sono state coltivate in fiasche, in adesione, in terreno chimicamente definito e supplementato di siero fetale bovino ultra low IgG, sotto atmosfera e temperatura controllate. L'espressione della proteina Ig-pCons, nel sopranatante delle cellule, è stata valutata, e quantificata, a intervalli di tempo crescenti dalla trasfezione. Sulla base delle concentrazioni di proteina ottenute, sono stati scelti i tempi di raccolta del sopranatante. E' stato, quindi, eseguito uno step di purificazione della proteina Ig-pCons per cromatografia di affinità: questa ha dato rese modeste per la bassa concentrazione di proteina nel sopranatante. Sono stati allora studiati approcci che ottimizzassero la resa di produzione di Ig-pCons, utilizzando lo stesso sistema di espressione. Questi comprendono l'aggiunta al terreno di coltura del sodio butirrato, a diverse concentrazioni e tempi, e del cocktail di inibitori delle proteasi. Si è trovato che la condizione migliore, che porta ad un incremento di quasi sei volte della concentrazione di Ig-pCons nel terreno di coltura, è quella che prevede l'aggiunta di sodio butirrato 2 mM a quattro ore dalla trasfezione, e degli inibitori delle proteasi. Infine, in collaborazione con il CNR del Bioindustry Park, è stato effettuato il sequenziamento N-terminale della proteina prodotta, che ha evidenziato la corretta presenza del peptide terapeutico pCons. Utilizzando il metodo di produzione studiato, ci si propone, in futuro, di incrementare la produzione della proteina Ig-pCons in modo da ottenerla in quantità sufficienti per realizzare gli studi in vivo, sul modello murino del LES.