ANALISI DELL’ATTIVITÀ ANTIOSSIDANTE DELL’ESTRATTO TOTALE DI FOGLIA DI MELOGRANO SU CELLULE ENDOTELIALI UMANE SOTTOPOSTE A STRESS OSSIDATIVO

Reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species can exert a negative effect on the human body, leading to oxidative stress and nitrosative stress conditions. Oxidative stress in particular, plays a fundamental role in the inflammatory process and in the development of pathologies such as obesity and type 2 diabetes mellitus. The human body, in order to defend against oxidative stress, has developed enzymatic and non-enzymatic defenses able to act on ROS, limiting therefore their damage on cells. Antioxidants are molecules able to contain the reactivity of ROS, decreasing the incidence of diseases related to them: among these, a wide relevance is reserved to the class of flavonoids. In general, for the human diet, fruits and vegetables represent a mine of valuable compounds for health; in particular, in this work the role of the pomegranate plant was deepened, because rich in natural bioactive compounds that are able to counteract oxidative stress and therefore to show a protective role, for example, at cardiovascular system level. The total extract (TE) of pomegranate leaves and three of the many compounds contained in this extract were therefore considered, specifically luteolin-4-O'-glucoside (L4G), ursolic acid (UA) and ellagic acid (EA). The aim of this thesis was to investigate in vitro the antioxidant activity of TE, L4G, UA and EA on a human umbilical endothelial cell line (HUVEC). After analyzing the cytotoxicity curves and IC50 of the four compounds aforementioned, non-cytotoxic concentrations were considered to study their antioxidant activity treating simultaneously cells with the compounds under investigation and with a pro-oxidant stimulation by hydrogen peroxide (H2O2, 500 μM) for 5 hours. In particular, L4G and UA did not show a statistically significant antioxidant activity, while EA at 100 μg/mL showed a statistically significant antioxidant activity. A similar but slight antioxidant activity was also observed after TE (250 μg/mL) incubation. Moreover, EA and TE were also studied pretreating cells for 24 hours before inducing the pro-oxidant stimulus (H2O2 500 μM for 5 hours). Observing the data, TE and EA showed antioxidant activity being extremely significant the EA antioxidant activity. Although further studies are needed, especially in in vivo models, these preliminary in vitro results confirm the validity to use TE of pomegranate leaves or EA in dietary supplements prepared for having antioxidant effects.

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e dell’azoto (RNS) possono esercitare un effetto negativo sull’organismo umano, portando a condizioni denominate, rispettivamente, stress ossidativo e stress nitrosativo. Lo stress ossidativo in particolare gioca un ruolo fondamentale nel processo infiammatorio e nello sviluppo di patologie quali obesità e diabete mellito di tipo 2. Allo scopo di difendersi dallo stress ossidativo, l’organismo umano ha sviluppato difese enzimatiche e non enzimatiche in grado di agire sui ROS, limitando così i danni che questi possono arrecare alle cellule. Gli antiossidanti sono molecole in grado di contrastare la reattività dei ROS, diminuendo così l’incidenza delle patologie ad esse correlate: tra questi, un’ampia rilevanza è riservata alla classe dei flavonoidi. In generale, per la dieta umana, la frutta e la verdura rappresentano una miniera di composti preziosi per la salute. In questo elaborato è stato approfondito il ruolo della pianta di melograno, in quanto ricca in composti naturali bioattivi che nell’insieme sono in grado di contrastare lo stress ossidativo e quindi avere un ruolo protettivo, ad esempio, a livello del sistema cardiovascolare. Sono stati dunque presi in considerazione l’estratto totale (TE) delle foglie di melograno e tre molecole in esso contenute: il luteolin-4-O’-glucoside (L4G), l’acido ursolico (UA) e l’acido ellagico (EA). Lo scopo di questo elaborato è stato quindi valutare, attraverso uno studio in vitro su una linea di cellule endoteliali ombelicali umane (HUVEC), l’attività come antiossidanti di TE, L4G, UA e EA, utilizzando come stimolo pro-ossidante il perossido di idrogeno (H2O2) alla concentrazione di 500 µM per 5 ore. Dopo aver analizzato le curve di citotossicità e l’IC50 dei quattro composti sopra citati, sono state utilizzate concentrazioni non citotossiche per studiarne l’attività antiossidante in concomitanza dello stimolo pro-ossidante. In particolare, L4G e UA non hanno mostrato un’attività antiossidante statisticamente significativa, mentre EA ha mostrato un’attività antiossidante statisticamente significativa a partire dalla concentrazione di 100 µg/ml, attività che è risulta essere presente, anche se in maniera meno significativa, per TE a 250 µg/ml. EA e TE sono inoltre stati utilizzati come pretrattamento per 24 ore, prima di esporre le cellule allo stimolo pro-ossidante (H2O2 500 µM per 5 ore). Anche in questo caso entrambi i composti hanno mostrato una attività antiossidante, in particolare molto significativa nel caso di EA. Per quanto siano necessari ulteriori studi, soprattutto in modelli in vivo, questi risultati confermano l’utilità sia di TE di foglie di melograno che di EA nella preparazione di integratori alimentari con proprietà antiossidanti.