Lattato deidrogenasi indipendente da fruttosio 1,6 bisfosfato: caratterizzazione ed effetti sulla produzione di acido lattico in C. thermocellum

Lactic acid (LA) is a sought-after product due to its countless industrial applications, and an increasing attention has been given to its sustainable production via microbial fermentation. Biotechnological production offers many advantages compared to chemical production, and lignocellulosic biomass derived from wastes has been proposed as an alternative feedstock to simple sugar or starchy biomass. Lignocellulose processing, however, is challenging and it requires many steps which contribute to increase costs and lower yield. Consolidated bioprocessing shape up to be the most efficient and cheapest strategy for undertaking the entire process. In nature microorganisms able to directly ferment lignocellulose and to produce LA at high yield have not been isolated, so far, so metabolic engineering is required for the development of a recombinant microorganism. Clostridium thermocellum, an anaerobic bacterium among the highest performing cellulose degraders, is one of the most promising microorganisms for application in CBP. In this study, a mutant lactate dehydrogenase (LDHS161R) discovered in C. thermocellum strain LL1111, independent from fructose 1,6-bisphosphate activation, was characterized focusing the attention on the effects of some potential modulators (NAD +, ATP, GTP, GDP, PPi): LDHS161R showed a strong inhibition by NAD + and ATP, while with GTP, GDP, and PPi a relevant inhibition was achieved at higher concentrations. Furthermore, C. thermocellum was engineered with the aim to overexpress the LDHS161R by cloning its gene in an expression plasmid and for the investigation of the effects of this mutant LDH on the C. thermocellum metabolism. The attempts in cloning this ldh gene in a plasmid involve two different inserts, PldhLL1111ldh and P2638promoter_LL1111ldh: in the first, ldh gene is under the control of the original (wild type) ldh gene promoter, and in the second under the control of strong and constitutive P2638 promoter. Moreover, a third insert with wild type ldh gene (wtldh) under the control of Pldh promoter was included as a reference. Transformation with vector containing P2638promoter_LL1111ldh was not successful, while transformation with the other two expression vectors led to an active protein and to the production of lactate at higher yields compared to the wild type strain.

L'acido lattico (LA) è un prodotto ricercato per le sue innumerevoli applicazioni industriali e una crescente attenzione è stata data alla sua produzione sostenibile tramite fermentazione microbica. La produzione biotecnologica offre molti vantaggi rispetto alla produzione chimica e la biomassa lignocellulosica derivata dai rifiuti è stata proposta come materia prima alternativa allo zucchero semplice o alla biomassa amidacea. La lavorazione della lignocellulosa, tuttavia, è impegnativa e richiede molti passaggi che contribuiscono ad aumentare i costi e ad abbassare la resa. Il bioprocesso consolidato si configura come la strategia più efficiente ed economica per intraprendere l'intero processo. In natura non sono stati finora isolati microrganismi in grado di fermentare direttamente lignocellulosa e di produrre LA ad alta resa, quindi è necessaria l'ingegneria metabolica per lo sviluppo di un microrganismo ricombinante. Clostridium thermocellum, un batterio anaerobico tra i degradatori della cellulosa più performanti, è uno dei microrganismi più promettenti per l'applicazione nella CBP. In questo studio è stata caratterizzata una lattato deidrogenasi mutante (LDHS161R) scoperta in C. thermocellum ceppo LL1111, indipendente dall'attivazione del fruttosio 1,6-bisfosfato, focalizzando l'attenzione sugli effetti di alcuni potenziali modulatori (NAD+, ATP, GTP, GDP , PPi): LDHS161R ha mostrato una forte inibizione da parte di NAD + e ATP, mentre con GTP, GDP e PPi è stata ottenuta un'inibizione rilevante a concentrazioni più elevate. Inoltre, C. thermocellum è stato ingegnerizzato con lo scopo di sovraesprimere LDHS161R clonando il suo gene in un plasmide di espressione e per studiare gli effetti di questa LDH mutata sul metabolismo di C. thermocellum. I tentativi di clonare questo gene ldh in un plasmide coinvolgono due diversi inserti, PldhLL1111ldh e P2638promoter_LL1111ldh: nel primo, il gene ldh è sotto il controllo del promotore originale del gene ldh (wild type), e nel secondo sotto il controllo di un promotore forte e costitutivo, P2638. Inoltre, è stato incluso come riferimento un terzo inserto con gene ldh wild type (wtldh) sotto il controllo del promotore Pldh. La trasformazione con il vettore contenente P2638promoter_LL1111ldh non ha avuto successo, mentre la trasformazione con gli altri due vettori di espressione ha portato ad una proteina attiva e alla produzione di lattato a rese maggiori rispetto al ceppo wild type.