Utilizzo del Comet Assay per valutare i danni genotossici ed epigenetici indotti da campioni di PM2,5

Il particolato atmosferico (PM) è l’inquinante atmosferico che maggiormente influenza la salute umana ed è stato classificato dalla IARC come cancerogeno per l’uomo (gruppo 1). Differenti studi hanno mostrato che il PM può indurre numerosi effetti a livello cellulare (es. citotossicità, mutagenicità genotossicità); è stato, inoltre evidenziato il ruolo delle alterazioni epigenetiche indotte dal PM nell’incremento della suscettibilità/progressione di numerose malattie. I test biologici su cellule dell’apparato respiratorio permettono una valutazione più completa dei rischi associati all’esposizione al PM. Il lavoro di questa tesi rientra in un progetto di collaborazione con l’ARPA Piemonte che ha l’obiettivo di valutare gli effetti biologici in vitro associati all’esposizione al PM campionato in alcuni siti rappresentativi della rete di monitoraggio piemontese. Questo progetto di tesi si è focalizzato sulla valutazione della genotossicità degli estratti di PM2,5 campionati nell’anno 2018 in cinque siti di monitoraggio (Settimo Torinese, Lingotto, Beinasco-TRM (termovalorizzatore), Vinchio e Dernice), utilizzando il comet assay su cellule dell’epitelio bronchiale (BEAS-2B). Il sito ARIA WEB di ARPA Piemonte è stato consultato per caratterizzare i diversi siti e definire l’andamento delle concentrazioni di PM e di eventuali inquinanti. La valutazione della citotossicità dei campioni di PM (saggio WST-1) ha permesso di determinare le concentrazioni da utilizzare con il comet assay. La mutagenicità è stata valutata con il test di Ames. Come atteso, le concentrazioni più alte di inquinanti e PM sono state osservate in autunno e in inverno in tutti i siti. Il test WST-1 ha rilevato una diminuzione della vitalità cellulare soprattutto nei mesi freddi. I risultati del test di Ames mostrano un andamento stagionale con picchi di massima attività mutagena nel periodo autunno-inverno. Il comet assay ha confermato l’andamento stagionale osservato con gli altri test biologici. Livelli di danno al DNA maggiori sono stati osservati nel sito di Settimo (traffico) in inverno e in autunno; livelli significativi di danno sono stati, inoltre, osservati nei mesi freddi anche nei siti Beinasco e Lingotto (fondo urbano e termovalorizzatore) in accordo con i risultati ottenuti con il test di Ames. A seguito delle crescenti evidenze degli effetti epigenotossici degli xenobiotici è necessario utilizzare un altro tipo di approccio, oltre a quello genotossicologico, al fine di valutare l’influenza del PM sull’epigenoma. Questo lavoro di tesi propone lo sviluppo e l’applicazione di una versione innovativa del comet assay (Methy-sens comet assay) in grado di valutare gli effetti di metilazione al DNA indotti da campioni di PM su cellule BEAS-2B. Le prove ef fettuate hanno permesso di mettere a punto le condizioni sperimentali (concentrazione enzimatica, tempi di incubazione, unwinding ed elettroforesi) da utilizzare con le cellule BEAS-2B per raggiungere una condizione in cui le cellule di controllo trattate con il solo buffer non presentavano comete e in cui le comete nelle cellule trattate con enzima presentavano un livello di danno ada tto ad evidenziare sia un effetto demetilante che ipermetilante. L’applicazione del test ai campioni di PM ha confermato l’applicabilità del protocollo ottimizzato a campioni reali evidenziando l’importanza di monitorare, in aggiunta agli altri effetti biologici, i potenziali effetti epigenetici del PM atmosferico