Determinazione degli ormoni steroidei in matrice sanguigna mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem e potenziali applicazioni nel campo delle analisi antidoping

Fin dagli anni ’70 gli steroidi androgeni anabolizzanti (AAS) sono stati ampiamente utilizzati come agenti dopanti negli sport perché aumentano la massa muscolare e la forza fisica, portando ad un aumento delle prestazioni sportive. Gli steroidi androgeni anabolizzanti endogeni (EAAS) sono una classe di composti endogeni che costituiscono il profilo steroideo urinario, implementato come modulo nel Passaporto Biologico dell’Atleta (ABP) a partire dal 1° gennaio 2014. Il profilo steroideo è ottenuto dall’analisi di campioni di urina: fornisce informazioni sulla via metabolica di composti androgeni ed è una delle principali strategie per identificare l’abuso di EAAS nello sport. Una delle sfide su cui sta lavorando la comunità antidoping è il possibile allargamento del profilo steroideo dall’urina alla matrice sanguigna, la quale permetterebbe di semplificare la raccolta del campione ed evitare la contaminazione e la manipolazione del campione. Per valutare questa possibilità, il laboratorio antidoping di Losanna accreditato presso la WADA, ha proposto per la prima volta il monitoraggio longitudinale delle concentrazioni di testosterone e DHT nel siero, che ha fornito uno strumento complementare al profilo degli steroidi urinari. L’obiettivo di questo progetto è quello di continuare la ricerca sul “profilo steroideo ematico” sviluppando un adeguato strumento analitico per la determinazione degli ormoni steroidei nella matrice sanguigna e testarne l’applicabilità nel complesso contesto del ABP. In questo lavoro è stato validato un metodo analitico di cromatografia liquida accoppiato alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la quantificazione di un’ampia lista di ormoni steroidei endogeni e dei relativi metaboliti di fase II in campioni di siero. Il metodo è stato validato in conformità con il documento International Standards for Laboratories (ISL). Sono state valutate l’interferenza della matrice e il rendimento di estrazione, selettività, linearità, bias, ripetibilità, precisione intermedia, limite di quantificazione (LOQ), limite di rivelabilità (LOD), robustezza, carry-over, e stabilità. Tale metodo è stato successivamente utilizzato per l’analisi di campioni di siero reali raccolti da individui sani presso l’Ospedale Universitario “Città della Salute e della Scienza” di Torino, permettendo di ottenere gli intervalli di riferimento degli ormoni steroidei endogeni e di descrivere per la prima volta la distribuzione dei differenti isomeri dell’androstandiolo glucuronato. È stata inoltre indagata l’influenza di possibili fattori confondenti sul nuovo “profilo steroideo ematico”. In particolare, per studiare l’effetto dell’esercizio fisico è stato avviato uno studio presso l’Università di Torino, all’interno del quale sono stati prelevati campioni di siero da calciatori professionisti prima e dopo un massimo di tre sessioni di allenamento nell’arco di un’intera stagione sportiva. Questa strategia di campionamento ha infatti permesso di ottenere ulteriori informazioni sulla stabilità del “profilo steroideo ematico” in un periodo di tempo più ampio. A seguito di questo studio è stato possibile osservare che il testosterone, il diidrotestosterone (DHT) e gli androgeni solfati non sono significativamente influenzati da un allenamento di media intensità, mentre la valutazione della variabilità intra-individuale ha evidenziato la stabilità di tutti i marcatori del doping con testosterone già proposti in letteratura.