Caratterizzazione molecolare del gene della vinilfenolo reduttasi di Dekkera bruxellensis

Nel vino, il carattere "Brett" si riferisce alla modifica delle caratteristiche sensoriali legate alla presenza di fenoli volatili, generalmente noti come off-flavours, prodotti dal lievito Brettanomyces / Dekkera bruxellensis. Questa caratteristica unica di B. / D. bruxellensis è determinata dall'attività enzimatica della vinilfenolo reduttasi (VPR), che catalizza la conversione dei vinilfenoli ad etilfenoli. La proteina responsabile di questa trasformazione è stata recentemente purificata e sequenziata. Questo risultato ha reso possibile, in questa tesi, sia l'identificazione del gene VPR sul genoma sequenziato del ceppo di D. bruxellensis CBS2499 che la clonazione in S. cerevisiae, specie non produttrice di etilfenoli. I cloni ricombinanti si sono mostrati in grado di esprimere una forma biologicamente attiva della proteina eterologa. Al fine di caratterizzare a livello genetico la sequenza codificante questo enzima, sono stati effettuati l'amplificazione, il sequenziamento ed infine l'allineamento delle sequenze del gene della VPR da una collezione internazionale di ceppi di B. / D.bruxellensis. L'elaborazione dei dati ha dimostrato che erano presenti polimorfismi a livello di singolo nucleotide (SNPs) che essenzialmente determinavano uno stato di eterozigosi degli alleli. La maggior parte dei polimorfismi individuati ha portato alla formazione di aminoacidi sinonimi, che indicano il mantenimento dell'attività biologica della proteina. Infine, la collezione di ceppi è stato sottoposto ad uno screening per la produzione di etil fenoli. I dati hanno confermato che la produzione era ceppo dipendente e, quindi, che potrebbe verificarsi una regolazione del livello di trascrizione / traduzione del messaggero-VPR.

In wine, "Brett" character refers to the alteration of the sensory features linked to volatile phenols, generally referred as off-flavors produced by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis. This unique characteristic of B./D. bruxellensis is determined by the enzymatic activity of vinyl phenol reductase (VPR), which catalyzes the conversion of vinyl phenols to ethyl-phenols. The protein responsible for this transformation has recently been purified and sequenced. This result made it possible, in this thesis, both the identification of the VPR gene on the genome sequenced strain of D. bruxellensis CBS2499 and the cloning in S. cerevisiae, species not producing ethyl phenols. The recombinant clones were capable of expressing a biologically active form of the heterologous protein. In order to characterize at genetic level the sequence encoding this enzyme, the amplification, sequencing and subsequent alignment of the sequences of the VPR from a collection of strains of B./D.bruxellensis was carried out. Data elaboration showed the single nucleotide polymorphisms (SNPs) were present and, in certain cases, a heterozygosity state of alleles was determined. Most of the SNPs led to synonymous changing of the amino acids indicating the maintenance of biologic protein activity. Finally, the strain collection was subjected to a screening for the production of ethyl phenols. Data confirmed that the production was strain dependent and, thus, that a regulation of transcription/traduction level of the VPR messenger could occur.