It's well known that the development of chemoresistance in many cancer types is accompanied by an increase of the intracellular glutathione (GSH) content. On the basis of this observation, we have planned our research work aiming to investigate the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs carried by cyclodextrin-based nanosponges sensitive to the intracellular concentration of glutathione (GSH-responsive β-Nss). These nanoparticles should facilitate the release of the drug in the presence of a high GSH concentration. The aim of this work was to evaluate the cytotoxic effect of doxorubicin on two colorectal cancer cell lines (HT-29 and HCT 116) and two lines of prostate cancer cells (PC-3 and DU 145) with different GSH content. Chemoresistant cell lines HCT 116 and DU 145 show a higher GSH content and a high ratio Nrf2/ KEAP1 (the inhibitor of Nrf2) and consequently an increased expression of cytoprotective enzymes, whereas the PC-3 and HT-29 cells have a lower GSH content and a low level of Nrf2 expression. First, the kinetics of internalization of doxorubicin carried by GSH-responsive β-Nss has been measured through confocal and fluorescence microscopy. A significant increase in the incorporation of doxorubicin carried by GSH-responsive β-Nss in all cell lines has been observed. In the next phase, we compared the effect of the chemotherapeutic drug, in free or vehicled form, on biochemical and molecular parameters which are affected by the treatment with doxorubicin. In particular, we analyzed cell viability by MTT assay, and ROS levels, cell cycle and apoptosis by flow cytometry. Moreover, we assessed the DNA damage by "comet assay" and the activity of topoisomerase II through a commercial kit. Our results demonstrated that doxorubicin carried by GSH-responsive β-Nss not only crosses the cell membrane more effectively than the free drug, but also it increases the toxic effects in terms of ROS production, cell cycle alteration, inhibition of topoisomerase II, DNA damage and induction of apoptosis. These effects are evident in those cell lines characterized by an higher GSH concentration. In conclusion, our results show that through an appropriate design, nanoparticles can carry chemotherapeutic drugs preferentially in chemoresistant cells with high GSH level.
È noto che lo sviluppo della chemioresistenza si accompagna, in numerose tipologie di tumori, ad un incremento del contenuto intracellulare di glutatione (GSH). Questa osservazione è stata alla base del nostro lavoro di ricerca, che si è concentrato sull'utilizzo di nanoparticelle di nuova progettazione: le disulfo-nanospugne a base ciclodestrinica (β-Nss) sensibili al GSH, contenenti un chemioterapico e impiegate per verificarne l'efficacia in cellule tumorali rispetto al farmaco libero. Queste nanoparticelle, infatti, dovrebbero facilitare il rilascio del farmaco veicolato in cellule con elevato contenuto di GSH. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l'effetto citotossico della doxorubicina su due linee cellulari tumorali di carcinoma del colon (HT-29 e HCT 116) e due della prostata (PC-3 e DU 145), con diverso contenuto di GSH. Le linee chemioresistenti HCT 116 e DU 145 presentavano un'alta concentrazione di GSH e un elevato rapporto Nrf2/ KEAP1 (inibitore di Nrf2) e, di conseguenza, un'espressione maggiore di enzimi citoprotettivi, mentre le cellule PC-3 e HT-29 erano caratterizzate da un basso contenuto di GSH ed una ridotta espressione di Nrf2. Inizialmente, è stata misurata la cinetica di internalizzazione della doxorubicina veicolata dalle β-Nss mediante microscopia a fluorescenza e confocale; si è osservato un notevole incremento dell'incorporazione del chemioterapico veicolato dalle β-Nss in tutte le linee cellulari rispetto al farmaco libero. Nella fase successiva della sperimentazione, abbiamo confrontato gli effetti della doxorubicina, libera o veicolata, sugli specifici parametri biochimico-molecolari che vengono alterati dal trattamento. In particolare, sono stati analizzati: la vitalità cellulare tramite saggio MTT, e i livelli di ROS, il ciclo cellulare e l'apoptosi con l'uso della citofluorimetria a flusso. Inoltre, abbiamo valutato il danno al DNA mediante il ¿comet assay¿ e l'attività della topoisomerasi II con l'uso di un kit commerciale. Considerando globalmente i risultati, è emerso che la doxorubicina veicolata dalle β-Nss non solo attraversa la membrana cellulare più efficacemente del farmaco libero, ma aumenta gli effetti tossici in termini di produzione di ROS, alterazione del ciclo cellulare, inibizione della topoisomerasi II, danno al DNA e induzione di apoptosi. Questi effetti, infine, sono risultati particolarmente evidenti nelle linee cellulari caratterizzate da un maggiore contenuto di GSH, come inizialmente ipotizzato. In conclusione, i nostri risultati dimostrano come attraverso una progettazione idonea di nanoparticelle si possano veicolare farmaci preferenzialmente in cellule tumorali chemioresistenti, con elevato contenuto di GSH.
Nanoparticelle sensibili al GSH nel trattamento delle cellule tumorali chemioresistenti
BALLARO', RICCARDO
2013/2014
Abstract
È noto che lo sviluppo della chemioresistenza si accompagna, in numerose tipologie di tumori, ad un incremento del contenuto intracellulare di glutatione (GSH). Questa osservazione è stata alla base del nostro lavoro di ricerca, che si è concentrato sull'utilizzo di nanoparticelle di nuova progettazione: le disulfo-nanospugne a base ciclodestrinica (β-Nss) sensibili al GSH, contenenti un chemioterapico e impiegate per verificarne l'efficacia in cellule tumorali rispetto al farmaco libero. Queste nanoparticelle, infatti, dovrebbero facilitare il rilascio del farmaco veicolato in cellule con elevato contenuto di GSH. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l'effetto citotossico della doxorubicina su due linee cellulari tumorali di carcinoma del colon (HT-29 e HCT 116) e due della prostata (PC-3 e DU 145), con diverso contenuto di GSH. Le linee chemioresistenti HCT 116 e DU 145 presentavano un'alta concentrazione di GSH e un elevato rapporto Nrf2/ KEAP1 (inibitore di Nrf2) e, di conseguenza, un'espressione maggiore di enzimi citoprotettivi, mentre le cellule PC-3 e HT-29 erano caratterizzate da un basso contenuto di GSH ed una ridotta espressione di Nrf2. Inizialmente, è stata misurata la cinetica di internalizzazione della doxorubicina veicolata dalle β-Nss mediante microscopia a fluorescenza e confocale; si è osservato un notevole incremento dell'incorporazione del chemioterapico veicolato dalle β-Nss in tutte le linee cellulari rispetto al farmaco libero. Nella fase successiva della sperimentazione, abbiamo confrontato gli effetti della doxorubicina, libera o veicolata, sugli specifici parametri biochimico-molecolari che vengono alterati dal trattamento. In particolare, sono stati analizzati: la vitalità cellulare tramite saggio MTT, e i livelli di ROS, il ciclo cellulare e l'apoptosi con l'uso della citofluorimetria a flusso. Inoltre, abbiamo valutato il danno al DNA mediante il ¿comet assay¿ e l'attività della topoisomerasi II con l'uso di un kit commerciale. Considerando globalmente i risultati, è emerso che la doxorubicina veicolata dalle β-Nss non solo attraversa la membrana cellulare più efficacemente del farmaco libero, ma aumenta gli effetti tossici in termini di produzione di ROS, alterazione del ciclo cellulare, inibizione della topoisomerasi II, danno al DNA e induzione di apoptosi. Questi effetti, infine, sono risultati particolarmente evidenti nelle linee cellulari caratterizzate da un maggiore contenuto di GSH, come inizialmente ipotizzato. In conclusione, i nostri risultati dimostrano come attraverso una progettazione idonea di nanoparticelle si possano veicolare farmaci preferenzialmente in cellule tumorali chemioresistenti, con elevato contenuto di GSH.| File | Dimensione | Formato | |
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