Caratterizzazione del ruolo di una LysM domain protein (LysM-AM3) nella simbiosi micorrizica arbuscolare in Oryza sativa

La simbiosi micorrizica arbuscolare (AM) si instaura tra le radici di circa l’80% delle piante terrestri e i funghi biotrofi del suolo appartenenti al sub-phylum Glomeromycotina. Questa associazione apporta notevoli vantaggi alla pianta ospite sia in termini di fitness sia di resistenza contro stress di tipo biotico e abiotico. I partner vegetali hanno mantenuto nel corso dell’evoluzione un insieme conservato di geni specializzati per accogliere il partner fungino. Tra questi geni si annoverano i geni AM marker, ovvero quei geni che vengono espressi esclusivamente durante la simbiosi AM. Precedenti studi di espressione genica sulle radici micorrizate della pianta di riso hanno evidenziato l’espressione specifica di due geni OsLysm-AM3 e OsLysm-AM15, codificanti per piccole proteine. Entrambe presentano un singolo motivo LysM e un peptide segnale. La loro espressione è fortemente indotta durante la simbiosi e pertanto sono usati come marcatori della presenza e della funzionalità della simbiosi. Dal momento che le loro specifiche funzioni rimangono ad oggi ignote, il progetto di tesi ha avuto l’obiettivo di decifrare il ruolo della proteina OsLysM-AM3 attraverso l’utilizzo di linee mutanti ottenute tramite un approccio Crispr-Cas9. Piante wild-type (WT) e due le linee mutanti indipendenti (oslysm-am3 2a1 e oslysm-am3 6a3) sono state cresciute in parallelo in condizioni micorrizate e non micorrizate. Al fine di caratterizzare il ruolo di OsLysM-AM3 nello sviluppo della pianta di riso in condizioni non micorrizate, le piante WT e mutanti sono state analizzate attraverso saggi morfometrici ed inoltre è stata valutata la fenologia dei diversi genotipi durante il loro ciclo vitale. In condizioni non micorrizate è stata anche quantificato il contenuto di strigolattoni (SLs) e di zaxinone (ZAX), apocarotenoidi coinvolti nello sviluppo della pianta di riso e nella simbiosi AM, in radici e negli essudati radicali. Per indagare il ruolo di OsLysM-AM3 nella simbiosi AM sono state effettuate invece analisi molecolari (espressione di geni AM marker, OsCERK, OsMYR1, OsPT11 e OsLysM-AM15), e morfologiche (metodo di Trouvelot e rapporto lunghezza arbuscolo/cellula) in radici di piante WT e delle linee mutanti oslysm-am3. I risultati ottenuti suggeriscono un ruolo determinante di OsLysm-AM3 nell’architettura e nello sviluppo della pianta di riso ed evidenziano che questo gene è coinvolto in due fasi distinte della simbiosi: la fase asimbiotica (extraradicale) e quella simbiotica (intraradicale). In particolare, durante le fasi precoci della simbiosi, OsLysm-AM3 è indotto dalle molecole fungine e pertanto è coinvolta nella percezione del partner fungino. L’incremento di SLs e ZAX nei mutanti suggerisce che OsLysm-AM3 giochi un ruolo determinante anche nella regolazione delle molecole rilasciate dall’ospite durante il riconoscimento tra i partners, che rivestono inoltre un ruolo nello sviluppo della pianta di riso. I risultati ottenuti mediante la tecnica dell’ibridazione in situ evidenziano un’espressione di OsLysm-AM3 nelle cellule arbuscolate, dove la proteina di interesse potrebbe essere secreta nello spazio periarbuscolare. L’incremento delle dimensioni dell’arbuscolo nei mutanti rispetto al WT suggerisce inoltre il ruolo di OsLysm-AM3 nel processo degenerativo dell’arbuscolo.