The term ELISA is the acronym for enzyme-linked immunosorbent assay and is used to identify immunoassay methods that fall into the category of enzyme immunoassays. In these assays, a substance to be measured binds to another (generally an antibody) to detect its presence and possibly quantify it. The substrate commonly used to highlight the formation of this bond is tetramethylbenzidine (TMB) which is oxidized by hydrogen peroxide in presence of horseradish peroxidase (HRP) forming a spectrophotometrically measurable colored compound. HRP represents a sensitive element of the assay that can lead to poor robustness. The purpose of this work is to find alternative processes to the use of horseradish peroxidase (based on photochemical processes) to improve the robustness and minimize the cost of ELISA assays. For this purpose, three photochemical processes have been studied: 1) Heterogeneous photocatalysis on TiO2: the replacement of the enzyme with TiO2 nanoparticles under UV irradiation allowed the production of oxidizing species allowing the non-use of the reactive H2O2 / HRP pair for the oxidation of TMB. The TiO2 surface was functionalized with a hapten to make it recognizable to the receptor molecule. Competitive tests were then carried out to study the specificity of the molecule-receptor bond. The tests carried out showed good signals but poor selectivity towards the target antibody. 2) Sensitization through organic molecules characterized by strongly oxidizing triplet states. The sensitization capacities of 4-carboxybenzophenone and anthraquinone2-sulfonate (AQ2S) were studied. The latter provided the most promising results; therefore, it was decided to use anthraquinone-2-carboxylate (AQ2C), which has a carboxyl group instead of the sulphonic one which made it easier to form a covalent bond with the antibody. After this step, the molecule was used in competitive assays to test its selectivity towards a receptor antibody. The results obtained in these tests were not satisfactory as there was no significant response in terms of signal or selective recognition. 3) Use of photofenton processes based on Fe (III) complexes with stable ligands. The complex considered is Fe (III) -EDTA which, subjected to irradiation in the presence of H2O2, can efficiently oxidize TMB. The antibody was then functionalized by means of the EDTA dianhydride to have binding agents for the Fe (III) ion on the antibody. The functionalized antibody was loaded with the maximum amount of Fe (III) that it could block and then used in a competitive assay. The results obtained proved to be promising by obtaining signals which, although significantly lower than those obtainable in assays with peroxidase, scale proportionally with the analyte concentration. Replacing HRP with cheaper and more robust systems is a major challenge. Among the three strategies tested, the use of photofenton systems is certainly promising. The results obtained represent in this sense a starting point for the development of an ELISA assay that does not use HRP. Further studies could concern the optimization of all the parameters that can influence the signal intensity and the specificity of the assay (H2O2 concentration, Fe (III) load, irradiation time, binder concentration on the surface…).
Il termine ELISA è l’acronimo di enzyme-linked immunosorbent assay e viene utilizzato per identificare metodi d’analisi immunologica che rientrano nella categoria dei test immunoenzimatici. In questi saggi, una sostanza da dosare si lega ad un’altra (generalmente un anticorpo) per rilevare la presenza ed eventualmente quantificarla. Il substrato comunemente utilizzato per evidenziare la formazione di tale legame è la tetrametilbenzidina (TMB) che viene ossidata mediante perossido di idrogeno in presenza di perossidasi di rafano (HRP) formando un composto colorato dosabile spettrofotometricamente. L’HRP rappresenta un elemento sensibile del saggio che può portare a scarsa robustezza. Lo scopo di questo lavoro è quello di trovare processi alternativi all’utilizzo della HRP (basati su processi fotochimica) al fine di migliorare la robustezza e minimizzare il costo dei saggi ELISA. A tale scopo sono stati studiati tre processi fotochimici: 1)La fotocatalisi eterogenea su TiO2: la sostituzione dell'HRP con nanoparticelle di TiO2 sotto irraggiamento UV ha permesso la produzione di specie ossidanti favorendo il non utilizzo della coppia reattiva H2O2/HRP per l’ossidazione della TMB. La superficie di TiO2 è stata funzionalizzata con un aptene in modo da renderlo riconoscibile alla molecola recettrice. Successivamente sono stati effettuati dei test competitivi per studiare la specificità del legame molecola-recettore. I test effettuati hanno mostrato buoni segnali ma scarsa selettività nei confronti dell’anticorpo target. 2)Sensibilizzazione tramite molecole organiche caratterizzate da stati tripletto fortemente ossidanti. Sono state studiate le capacità di sensibilizzante del 4-carbossibenzofenone e dell’antrachinone2-solfonato (AQ2S). Quest’ultima ha fornito i risultati più promettenti. Si è optato quindi per utilizzare l’antrachinone-2-carbossilato (AQ2C), il cui gruppo carbossilico invece di quello solfonico ha favorito la formazione di un legame covalente con l’anticorpo. Dopo questo passaggio si è passati all’utilizzo della molecola in saggi competitivi per testarne la selettività verso un anticorpo recettore. I risultati ottenuti in questi test non sono stati soddisfacenti poiché non si è osservata una risposta rilevante in termini di segnale né riconoscimento selettivo.3)Utilizzo di processi fotofenton a base di complessi di Fe3+ con leganti stabili. Il complesso preso in considerazione è il Fe(III)-EDTA il quale sottoposto ad irraggiamento in presenza di H2O2 è in grado di ossidare efficacemente la TMB. Si è poi passati alla funzionalizzazione dell’anticorpo mediante dianidride dell’EDTA al fine di avere sull’anticorpo leganti per lo ione Fe(III). L’anticorpo funzionalizzato è stato caricato con la massima quantità di Fe3 che poteva bloccare e quindi utilizzato in un saggio competitivo. I risultati ottenuti si sono dimostrati promettenti ottenendo segnali che, seppur relativamente inferiori rispetto a quelli ottenibili in saggi con perossidasi, scalano proporzionalmente con la concentrazione di analita. La sostituzione della HRP con sistemi più economici e robusti è un’importante sfida. Tra le tre strategie provate, l'utilizzo di sistemi fotofenton è sicuramente promettente. I risultati ottenuti rappresentano un punto di partenza per la messa a punto di un saggio ELISA che non utilizzi HRP. Studi futuri potrebbero riguardare i parametri che influiscono il segnale e la specificità del saggio (H2O2, carico di Fe3+, irraggiamento, legante)
Applicazioni di processi fotochimici in saggi ELISA
LIBRIZZI, GIUSEPPE FEDERICO
2020/2021
Abstract
Il termine ELISA è l’acronimo di enzyme-linked immunosorbent assay e viene utilizzato per identificare metodi d’analisi immunologica che rientrano nella categoria dei test immunoenzimatici. In questi saggi, una sostanza da dosare si lega ad un’altra (generalmente un anticorpo) per rilevare la presenza ed eventualmente quantificarla. Il substrato comunemente utilizzato per evidenziare la formazione di tale legame è la tetrametilbenzidina (TMB) che viene ossidata mediante perossido di idrogeno in presenza di perossidasi di rafano (HRP) formando un composto colorato dosabile spettrofotometricamente. L’HRP rappresenta un elemento sensibile del saggio che può portare a scarsa robustezza. Lo scopo di questo lavoro è quello di trovare processi alternativi all’utilizzo della HRP (basati su processi fotochimica) al fine di migliorare la robustezza e minimizzare il costo dei saggi ELISA. A tale scopo sono stati studiati tre processi fotochimici: 1)La fotocatalisi eterogenea su TiO2: la sostituzione dell'HRP con nanoparticelle di TiO2 sotto irraggiamento UV ha permesso la produzione di specie ossidanti favorendo il non utilizzo della coppia reattiva H2O2/HRP per l’ossidazione della TMB. La superficie di TiO2 è stata funzionalizzata con un aptene in modo da renderlo riconoscibile alla molecola recettrice. Successivamente sono stati effettuati dei test competitivi per studiare la specificità del legame molecola-recettore. I test effettuati hanno mostrato buoni segnali ma scarsa selettività nei confronti dell’anticorpo target. 2)Sensibilizzazione tramite molecole organiche caratterizzate da stati tripletto fortemente ossidanti. Sono state studiate le capacità di sensibilizzante del 4-carbossibenzofenone e dell’antrachinone2-solfonato (AQ2S). Quest’ultima ha fornito i risultati più promettenti. Si è optato quindi per utilizzare l’antrachinone-2-carbossilato (AQ2C), il cui gruppo carbossilico invece di quello solfonico ha favorito la formazione di un legame covalente con l’anticorpo. Dopo questo passaggio si è passati all’utilizzo della molecola in saggi competitivi per testarne la selettività verso un anticorpo recettore. I risultati ottenuti in questi test non sono stati soddisfacenti poiché non si è osservata una risposta rilevante in termini di segnale né riconoscimento selettivo.3)Utilizzo di processi fotofenton a base di complessi di Fe3+ con leganti stabili. Il complesso preso in considerazione è il Fe(III)-EDTA il quale sottoposto ad irraggiamento in presenza di H2O2 è in grado di ossidare efficacemente la TMB. Si è poi passati alla funzionalizzazione dell’anticorpo mediante dianidride dell’EDTA al fine di avere sull’anticorpo leganti per lo ione Fe(III). L’anticorpo funzionalizzato è stato caricato con la massima quantità di Fe3 che poteva bloccare e quindi utilizzato in un saggio competitivo. I risultati ottenuti si sono dimostrati promettenti ottenendo segnali che, seppur relativamente inferiori rispetto a quelli ottenibili in saggi con perossidasi, scalano proporzionalmente con la concentrazione di analita. La sostituzione della HRP con sistemi più economici e robusti è un’importante sfida. Tra le tre strategie provate, l'utilizzo di sistemi fotofenton è sicuramente promettente. I risultati ottenuti rappresentano un punto di partenza per la messa a punto di un saggio ELISA che non utilizzi HRP. Studi futuri potrebbero riguardare i parametri che influiscono il segnale e la specificità del saggio (H2O2, carico di Fe3+, irraggiamento, legante)| File | Dimensione | Formato | |
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