New biotechnological approaches in Globe Artichoke: PPOs mining and setting up of genetic transformation protocols

Il carciofo (Cynara cardunculus var. scolymus L.) è una specie di interesse agroalimentare, appartenente alla famiglia delle Asteraceae. È economicamente importante per la sua attività antiossidante derivante dall’alto contenuto in composti polifenolici, tuttavia, a seguito del taglio, i tessuti subiscono un processo ossidativo, mediato dall’azione delle polifenolo-ossidasi (PPO), che causa l’imbrunimento dei tessuti interessati. Questo processo porta ad una riduzione della capacità antiossidante del carciofo, diminuendone il valore nutrizionale e la durata della conservazione. Ad oggi, le strategie più efficienti per il controllo dell’attività delle PPO si basano sull’ingegneria genetica ma in letteratura mancano esempi sul carciofo. In questa tesi tramite analisi bioinformatiche sono state identificate 11 sequenze proteiche PPO, successivamente analizzate per definire il profilo dei domini funzionali tirosinasico, DWL e KFDV. Le analisi filogenetiche (sulle sequenze proteiche), assieme alle analisi dei siti di legame dei fattori di trascrizione (svolte su 1 Kbp a monte del codone di start) hanno evidenziando che l’espressione è regolata dallo stimolo luminoso e da ormoni coinvolti in senescenza e stress biotici. In quattro varietà sono stati identificati SNP e Indel rispetto al genoma di riferimento v.2.0; si nota un’elevata varianza allelica e la presenza di diverse mutazioni ad alto impatto (in PPO5 di VT; in PPO8 per C3, SP, VS). Inoltre sono state effettuate analisi di espressione genica in PCR quantitativa in tempo reale (RTqPCR) per valutare sperimentalmente la regolazione trascrizionale dei geni PPO ed identificare quelli potenzialmente coinvolti nell’imbrunimento dei tessuti. Le PPO1, 2 e 6 sono risultate maggiormente espresse nei tessuti del capolino secondario. Inoltre 15 min dopo il taglio, si nota un incremento della trascrizione per le PPO1, 2, 6, e 11 rispetto al tempo zero, in modo particolare nei tessuti del capolino secondario. Sulla base dei risultati ottenuti, le PPO6 e 11 sono risultate maggiormente indotte nei tessuti soggetti ad imbrunimento. A causa della recalcitranza del carciofo alla rigenerazione in vitro, è stata valutata l’efficienza di trasformazione e organogenesi in esperimenti pilota condotti su diversi tessuti della pianta utilizzando l’espressione ectopica di geni regolatori dello sviluppo e/o geni reporter veicolati tramite Agrobacterium tumefaciens. Apici meristematici di Spinoso di Sardegna sono stati trasformati utilizzando due differenti protocolli (micro-iniezione e co-coltura) e due plasmidi contenenti rispettivamente i geni reporter beta-glucoronidasi e Green Fluorescent Protein. Differentemente, nella varietà Romanesco C3 le trasformazioni sono state condotte a partire da espianti fogliari trasformati per mezzo di co-coltura e con l’utilizzo di due plasmidi, contenenti rispettivamente i geni regolatori dello sviluppo WUSCHEL (WUS) e BABY BOOM (BBM) e il macchinario di gene editing basato su CRISPR/Cas9 assemblato per indurre il knockout del gene marcatore visuale fitoene desaturasi (PDS). È stata valutata l’incidenza dei protocolli e si è evidenziato che la microiniezione ha un impatto negativo, portando alla morte del 15-20% degli espianti. Nel caso di espianti fogliari l’uso di regolatori dello sviluppo permette un tasso di callogenesi maggiorato del 20%. Analisi successive verranno quindi condotte per valutare molecolarmente e fenotipicamente le piante rigenerate.