Validazione di una nuova metodica di Ibridazione in situ in campo chiaro (ISH) nella valutazione del gene HER2: utilità e implicazioni nel laboratorio di Anatomia Patologica

Background: il tumore della mammella rappresenta la neoplasia più frequente nella donna, in qualunque classe di età. Da anni è noto come questo carcinoma sia profondamente eterogeneo e caratterizzato da outcome differenti e da differenti risposte a alle terapie oncologiche. Per indirizzare correttamente il team multidisciplinare alla corretta gestione della paziente con carcinoma della mammella, il patologo si avvale di una serie di marcatori prognostico e predittivi, fra cui la proteina cERBb2. Tale proteina è un recettore per fattori di crescita, appartenente alla famiglia dei recettori EGF. Nel carcinoma mammario può essere sovra-espressa nel 15-20% dei casi, definendo un gruppo di tumori con prognosi avversa, ma curabili con un anticorpo monoclonale diretto proprio verso tale proteina. cERB-B2 ed il gene che la codifica (HER2) rappresentano quindi un fattore prognostico e predittivo nel carcinoma mammario.La determinazione dello stato di Cerb-B2 avviene tradizionalmente mediante un approccio immunoistochimico (valutando l’espressione della proteina) e in casi dubbi (che corrispondono ad una positività intermedia, definita SCORE 2+, secondo le liee guida internazionali ASCO) si procede alla valutazione dell’amplificazione del gene, quindi allo studio del DNA. Tale approccio viene tradizionalmente effettuato con sonde dirette sia verso il gene HER2, che verso un gene di controllo che mappa nella regione centromerica del cromosoma 17 (CEP 17), attraverso la FISH (fluorescent in situ hybridisation). In particolare si effettua il rapporto tra segnali corrispondenti al gene e quelli corrispondenti al CEP17. Tale ratio, mediante l’utilizzo del cut off di 2, consente di classificare i tumori in positivi per HER2 (ratio >2) o al contrario negativi (ratio <2).L’obiettivo del nostro studio è stato quello di validare una metodica alternativa alla FISH, che consente di valutare l’ibridazione in situ utilizzando sonde cromogeniche che possono essere visualizzate al microscopio ottico (ISH in campo chiaro).Metodi: abbiamo selezionato una casistica di 53 tumori della mammella con Cerb-B2 score immunoistochimico 2+, precedentemente sottoposte ad indagini di FISH (utilizzata come metodica gold standard). In ogni caso è stata valutata l’ISH in campo chiaro utilizzando il sistemaVENTANA HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Il kit di rilevazione contiene un anticorpo primario e un anticorpo secondario marcato con l’enzima e coniugato alla perossidasi di rafano (HRP) o alla fosfatasi alcalina (AP) utilizzata come enzima cromogeno. Nel corso della doppia procedura di colorazione mediante ibridazione in situ, le sonde marcate con segnale nero e rosso sono co-ibridate per le sequenze di DNA target (rispettivamente HER2 e CEP 17)Tutte le sezioni sono state poi sottoposte a controcolorazione con Ematossilina.Le valutazioni effettuate sono state di tipo tecnico pre-analitico (tempo della procedura, omogeneità di reazione, sezione preservata in modo ottimale) e di tipo analitico. Infatti, per ogni caso, valutato al microscopio ottico con obiettivi a 20x, 40x e 100x, è stata calcolata la ratio, il numero di copie di HER2 ed il numero di copie di CEP 17. Tali dati sono stati confrontati (rigorosamente in cieco) con la metodica FISH, utilizzata come gold standard nel nostro studio.RisultatiIl tempo di allestimento della metodica è decisamente più breve rispetto a quello di esecuzione della FISH (6,5 ore rispetto a 48 ore rispettivamente). La metodica è totalmente automatizzata (al contrario della FISSH che prevede dei passaggi manuali). In 2 casi su 49 l’ibridazione con ISH in campo chiaro non è avvenuta per motivi legati verosimilmente al tipo di tessuto/fissazione. In tutti gli altri casi valutati la concordanza con la FISH è risultata elevatissima (96%).ConclusioneI nostri risultati appaiono convincenti per l’implementazione alla diagnostica routinaria di questo nuovo metodo.