Allergene arachide: studio comparativo tra i metodi ELISA e PCR

"That for a person is food, it may be poison for another." Food allergies involve abnormal responses to specific food triggering an allergic reaction. Of these allergies, 90% is attributed to 8 food: milk, eggs, shellfish, fish, peanuts, soybeans, nuts and grains. The main identified food allergens are soluble proteins or glycoproteins, very stable to heat and acid and enzymatic degradation. To protect allergic sufferers and allow consumers to easily identify the allergen residues in food, you need an accurate and unambiguous labeling. The current relevant legislation is the role book (EU) No 1169/2011. As the impact of allergens may have on the health of hypersensitive people, it is necessary to indicate possible danger on the label. This evidence will be covered in the analysis phase of the dangers of self-control plan. Moreover, on 2005 the standard ISO 22000 founded, that is a standard that was designed in order to harmonize the national and international standards in food safety. Due to growing number of allergic reactions, it is essential to have fast and reliable analytical methods for the detection of allergens in food products, which can be divided into direct or indirect. The direct approach detects the allergenic protein by ELISA methods such as the competitive or sandwich ELISA and lateral flow, while the indirect approach does not directly detect the protein but specific nucleotide sequences using techniques of PCR or RT-PCR. An important allergen, due to its spread, persistence and the potential severity of the allergic reaction, even on residues, seems to be the peanut. The allergens of this fruit known until today are 11 types of proteins, including Ara h1 and Ara h2, the most allergenic. The allergenic activity of some proteins increases with the roasting, but decreases the detection of the target molecule by ELISA and RT-PCR. Currently, the ELISA technique is the most used in the food industries, and an instrument (CHEMWELL 2910) for the automation of the analysis has been developed. CHEMWELL instrument, with RIDASCREEN Fast Peanut (LOD 1.5 mg/kg and LOQ 2.5 mg/kg), is able to obtain the same or similar results compared manual analysis. As next step, it was verified that the RT-PCR method (used for the first time for the search of peanuts in 2003) is a important protocol of confirmation of ELISA analysis. The kit adopted for the extraction is the SureFood PREP Allergen, for amplifying the SureFood Quant Peanut Allergen (LOD 1.0 mg / kg and LOQ 4.0 mg / kg) that uses the chemistry of Taq Polymerase. Starting from a reference material (QUANTARD 40) it is possible to transform the DNA copies in mg/kg of peanut (possibly present in the food matrix); the range of quantification is 1-400 mg/kg. In terms of sensitivity, bibliographic data have shown that the two techniques are widely comparable, rather, the RT-PCR technique is sometimes also more sensitive immunoassay method. However, in terms of speed, simplicity of analysis execution and safety data, the ELISA technique is more easy to perform.

¿Quello che per un individuo è cibo, può essere veleno per un altro¿. Le allergie alimentari coinvolgono risposte anormali a specifici alimenti scatenando una reazione allergica. Di queste allergie, il 90% viene attribuita a 8 alimenti: latte vaccino, uova, crostacei, pesce, arachidi, soia, frutta a guscio e cereali. I principali allergeni alimentari identificati sono proteine o glicoproteine idrosolubili molto stabili al calore e alla degradazione acida ed enzimatica. Per proteggere i soggetti allergici e consentire al consumatore di identificare facilmente i residui di allergeni contenuti nei prodotti alimentari, è necessaria un'accurata ed inequivocabile etichettatura. L'attuale normativa di riferimento è il regolamento (UE) N. 1169/2011. Considerato l'impatto che gli allergeni possono avere sulla salute di soggetti ipersensibili, la mancata indicazione degli stessi in etichetta rientra nella definizione di pericolo. Tale evenienza dovrà dunque essere contemplata in fase di analisi dei pericoli nel piano di autocontrollo. Inoltre, nel 2005 nasce lo standard ISO 22000 che è una norma creata al fine di armonizzare gli standard nazionali e internazionali in materia di sicurezza alimentare e HACCP. A causa del numero crescente di reazioni allergiche, risulta di fondamentale importanza avere metodi analitici veloci ed affidabili per la rilevazione di allergeni nei prodotti alimentari, che si possono suddividere in diretti o indiretti. I primi rilevano la proteina allergizzante mediante metodi immunoenzimatici come l' ELISA competitivo o a sandwich ed il lateral flow, i secondi non rilevano direttamente la proteina ma particolari sequenze nucleotidiche utilizzando tecniche di PCR o RT-PCR. Un allergene di notevole importanza, a causa della sua diffusione, persistenza e per il potenziale di gravità della reazione allergica, anche su residui, risulta essere l'arachide. Gli allergeni di questo frutto che sono stati descritti fino ad oggi sono 11 tipologie di proteine, tra cui Ara h1 e Ara h 2 sono le maggiormente allergizzanti. L'attività allergenica di alcune proteine aumenta con la tostatura, ma diminuisce il rilevamento delle molecola bersaglio mediante test ELISA e RT-PCR. Attualmente, la tecnica ELISA è la più utilizzata nelle industrie alimentari, infatti, è stato sviluppato uno strumento (ChemWell 2910) per l'automatizzazione dell'analisi. È stato valutato se l'apparecchio ChemWell, abbinato al kit RidaScreen Fast Peanut (LOD 1,5 mg/kg e LOQ 2,5 mg/kg), è in grado di ottenere risultati uguali o simili rispetto all'analisi manuale. Come passaggio successivo, è stato verificato il metodo RT-PCR (utilizzato per la prima volta per la ricerca di arachidi nel 2003) come protocollo di conferma dell'analisi ELISA. Il kit adottato per l'estrazione è il SureFood PREP Allergen, per l'amplificazione il SureFood Allergen Quant Peanut (LOD 1,0 mg/kg e LOQ 4,0 mg/kg) che utilizza la chimica della Taq Polymerase. Mediante un materiale di riferimento (QUANTARD 40) è possibile trasformare le copie di DNA in mg/kg di arachide eventualmente presente nella matrice alimentare, il range di quantificazione è 1-400 mg/kg. In termini di sensibilità, alcuni lavori di ricerca hanno dimostrato che le due tecniche sono ampiamente paragonabili anzi, la tecnica RT-PCR è a volte anche più sensibile del metodo immunoenzimatico. In termini di velocità, semplicità di esecuzione dell'analisi e sicurezza del dato, la tecnica ELISA risulta di più facile esecuzione.