Approccio biotecnologico per la produzione in step multipli di acidi grassi polinsaturi da Chlorella minutissima

Microalgae are photosynthetic microorganisms that can rapidly grow even in adverse environmental conditions. In the last decade, a growing market share refers to a large-scale cultivation of microalgae for the production of pharmaceuticals and health supplements. Chlorella minutissima is a unicellular alga widely used for the large-scale production of biomass because of its relative fast growth and easy cultivation. Moreover, the accumulation of mono- and poly-unsaturated fatty acids have been reported. Therefore, different growth conditions have been investigated to optimize Chlorella biomass production and the unsaturated fatty acid accumulation for pharmaceutical and food industries. We tested the effects of nitrogen starvation, photosynthetic photon flux density (PPFD), mixotrophic growth and cold stress on biomass production and lipid accumulation. Chlorella was cultivated in nitrogen and in nitrogen-depleted media, at 100 and 200 µmol m-2 s-1 (PPFD). The effects of mixotrophy on biomass and lipid productivity was evaluated by the addition of glycerol as a carbon source. To evaluate the effects of cold stress on fatty acid composition, nitrogen-starved algae grown in myxotrophic media were incubated for 72 h at different cold/light conditions (200 PPFD/10°C, Dark/10°C, 200 PPFD/25°C and Dark/25°C). Biomass accumulation was monitored by spectrophotometry at 680 nm, and qualitative and quantitative analysis of fatty acids (FAs) were performed by gas chromatography coupled with either mass spectrometry or flame ionization detection. The highest biomass productivity was reached with the growth media supplied with nitrogen source after 9 days post inoculum, while the different PPFDs did not affect the biomass accumulation. With respect to autotrophic cultivation, a lower biomass accumulation was observed at 100 PPFD during mixotrophy cultivation, while at 200 PPFD the biomass accumulation was even more reduced. The fatty acid quantitative analysis showed the highest concentration of total fatty acids in nitrogen-depleted mixotrophic cultures, both at 100 PPFD (520.85 ±31.41µg mg-1 d.w.) and 200 PPFD (596.1 ±90.51µg mg-1 d.w.). However, the total FA yield did not show significant (P>0.05) differences among the different tested conditions. The ratio between the total unsaturated FAs (UFA) and saturated FAs (SFA) significantly increased upon cold stress (10°C) only in the dark (UFA/SFA=1.3 ±0.01). Whereas at 200 PPFD/10°C and in Dark/25°C treatments did not induce a significant increase of the UFA/SFA ratio (0.84 ±0.04 and 0.9 ±0.07, respectively) with respect to the control (200 PPFD/25 °C; 0.8 ±0.04). These results suggest that C. minutissima biomass and FAs are strongly affected by the nitrogen supply and mixotrophic growth conditions. The biomass accumulation can be stimulated by the addition of a nitrogen source in the media, although significant differences on biomass accumulation have not been observed between 100 and 200 PPFD. However, a significant FA content can be induced by the addition of glycerol as a carbon source in nitrogen-depleted media. To modulate the qualitative profile of accumulated FAs, a short cold/dark stress might be applied on growing biomass. The results of this study suggest a novel culture model based on the sequential use of three different growth conditions. This design can improve C. minutissima biomass production, fatty acids accumulation and modulation of the unsaturated and saturated FA ratio.

Le microalghe sono microrganismi fotosintetici in grado di crescere rapidamente anche in condizioni ambientali avverse. Negli ultimi anni una crescente quota di mercato è stata dedicata alla coltivazione su larga scala di alghe per la produzione di prodotti farmaceutici e integratori alimentari. Chlorella minutissima è un'alga unicellulare utilizzata per la produzione in larga scala di biomassa, date la crescita relativamente rapida e la facile coltivazione; inoltre è nota per l'accumulo in quantità significative di lipidi. Pertanto, differenti condizioni di crescita sono state testate per ottimizzare la produzione di biomassa di Chlorella e l'accumulo di acidi grassi (AG) polinsaturi di interesse per le industrie farmaceutiche e alimentari. In questo studio sono stati valutati gli effetti della carenza di azoto, la densità di flusso fotonico fotosintetico (PPFD), la crescita in mixotrofia e lo stress da freddo sulla produzione di biomassa e accumulo di AG. Chlorella è stata coltivata in mezzo con e privo di azoto, a 100 e 200 µmol m-2 s-1 (PPFD). Gli effetti della mixotrofia sulla produttività di biomassa e di AG sono stati valutati mediante l'aggiunta di glicerolo come fonte di carbonio. Per valutare gli effetti dello stress da freddo sulla composizione degli AG, alghe coltivate in mixotrofia e in assenza di azoto sono state incubate per 72 ore in differenti condizioni di luce e freddo (200 PPFD/10°C, buio/10°C, 200 PPFD/25°C e buio/25°C). La crescita in biomassa è stata valutata per via spettrofotometrica a 680 nm, mentre la variazione qualitativa e quantitativa degli AG è stata analizzata rispettivamente mediante GC-MS e GC-FID. La produzione di biomassa più elevata è stata raggiunta con il mezzo contenente azoto dopo 9 giorni dall'inoculo, mentre le differenti PPFDs non hanno influenzato l'accumulo di biomassa. Rispetto al mezzo autotrofo, è stato osservato un minore accumulo di biomassa a 100 PPFD in mixotrofia, mentre a 200 PPFD l'accumulo di biomassa era ancora più ridotto. Il maggior accumulo di AG totali è stato riscontrato in mixotrofia e in assenza di azoto, sia a 100 PPFD (520.85 ±31.41 µg mg-1 p.s.) che a 200 PPFD (596.1 ±90.51 µg mg-1 p.s.). Tuttavia, la resa totale degli AG non ha mostrato differenze significative (P>0.05) tra le diverse condizioni studiate. Il rapporto fra gli AG polinsaturi totali (AGP) e gli AG saturi (AGS) è aumentato significativamente con lo stress da freddo (10°C) soltanto al buio (AGP/AGS=1.3 ±0.01), mentre a 200 PPFD/10°C e al buio/25°C non è stato osservato un incremento significativo (rispettivamente 0.84 ±0.04 e 0.9 ±0.07) rispetto al controllo (200 PPFD/25 °C; 0.8 ±0.04). Questi risultati indicano che la produzione di biomassa e AG in C. minutissima è stata fortemente influenzata dalla disponibilità di azoto e dalla mixotrofia. L'accumulo di biomassa può essere indotto mediante l'aggiunta di una fonte di azoto nel mezzo. Inoltre, un contenuto significativo di AG può essere indotto mediante aggiunta di glicerolo come fonte di carbonio nel mezzo privo di azoto. Per modulare il profilo qualitativo degli AG accumulati, può essere applicato un breve stress da freddo e buio sulla biomassa coltivata. I risultati di questo studio propongono quindi un nuovo modello di coltura basato sull'utilizzo sequenziale di tre differenti condizioni di crescita. Questo modello può migliorare la produzione di biomassa di C. minutissima, l'accumulo di AG e la modulazione del rapporto fra AG insaturi e saturi.