Tecniche di biologia molecolare applicate allo studio delle cicaline vettori di fitoplasmi alla vite.

Phytoplasmas are phytopathogenic uncultivable prokaryotes lacking cell wall, which reside in plant sieve tubes and in the body of phloem-sucking insects in the order Hemiptera, which are responsible for their transmission. Phytoplasmas are transmitted by vectors in a persistent propagative manner. Acquisition takes place following nutrition on the phloem of an infected plant. After an incubation period, the pathogens reach salivary glands of the vector and are able to inject them while feeding on a healthy plant. Phytoplasma-borne diseases, called grapevine yellows, have a very high impact on viticulture; major diseases in this group are Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN). Such diseases are caused by different phytoplasmas, namely 'Candidatus Phytoplasma vitis' (16SrV) for FD and 'Ca . Phytoplasma solani' (16SrXII) for BN. Their vectors are Scaphoideus titanus Ball and Hyalesthes obsoletus Signoret, respectively. The study of phytoplasma vectors to grapevine and their relationships with the phytoplasma and the host plant is necessary to develop effective and environmentally friendly strategies aimed to contain grapevine yellows. In this context molecular biology techniques provide a valuable support to research. Molecular techniques are being used in phytoplasma classification and for disease monitoring in different sites. They are also universally used as a tool in the study of new vector species, to increase knowledge on the biology of insects and pathogens, and for the characterization of the tri-trophic interaction insect-plant-phytoplasma. After purification of nucleic acids, molecular biology techniques used for FD and BN diagnosis in well-known or putative vectors are mainly based on nested PCR protocols followed by RFLP analyses; Real-Time PCR is commonly used as well. The most often used genetic marker is the entire or partial ribosomal 16S rDNA gene. Within the study of the insect vectors, molecular biology techniques may be of particular utility for specific identification of juveniles and females, with a special regard to cixiid, involved in the transmission of BN, for which the morphological identification is extremely difficult. PCR followed by RFLP analysis are employed for this purpose; markers most frequently used are the ITS2 region of ribosomal DNA and the COI gene of mitochondrial DNA. Molecular biology is also used in the study of microbial symbionts of insect vectors, which represents a possible new tool in the containment of phytoplasma-borne diseases of grapevine, through the development of symbiotic control strategies. For the study of the composition of microbial communities molecular biology techniques, based on PCR followed by electrophoretic separation in special conditions, are often used. Such techniques include LH-PCR, DGGE, T-RFLP and SSCP. The target DNA for these analyses is the 16SrDNA gene, as well as for phytoplasmas detection.

I fitoplasmi sono fitopatogeni procarioti incoltivabili, privi di parete cellulare che vivono nei tessuti cribrosi delle piante e nel corpo degli insetti floemomizi nell'ordine Hemiptera, che sono responsabili della loro trasmissione. La trasmissione dei fitoplasmi, di tipo persistente propagativo, prevede un'acquisizione in seguito all'ingestione della linfa elaborata di una pianta infetta. In seguito, al termine di un periodo di incubazione, i patogeni, raggiunte le ghiandole salivari del vettore, vengono rilasciati tramite l'alimentazione. I fitoplasmi sono responsabili di fitopatie molto impattanti sulla viticoltura, chiamate giallumi della vite; le principali malattie all'interno di questo gruppo sono la Flavescenza dorata (FD) e il Legno nero (LN). I vettori dei fitoplasmi responsabili di queste malattie, vale a dire 'Candidatus Phytoplasma vitis' (16SrV) per la FD e 'Ca. Phytoplasma solani' (16SrXII) per il LN, sono rispettivamente Scaphoideus titanus Ball e Hyalesthes obsoletus Signoret. Lo studio degli insetti vettori di fitoplasmi alla vite e del loro rapporto con i patogeni e con la pianta ospite è necessario per lo sviluppo di strategie efficaci e a ridotto impatto sull'agroecosistema-vigneto, mirate a contenere i giallumi della vite. In questo contesto le tecniche di biologia molecolare possono fornire un valido supporto alla ricerca. Tecniche molecolari sono utilizzate nella classificazione dei fitoplasmi e per il monitoraggio delle malattie in diversi areali. Inoltre sono comunemente impiegate come strumento di studio per la ricerca di nuove specie di vettori, per l'ampliamento delle conoscenze sulla biologia degli insetti e dei patogeni, e per la caratterizzazione dell'interazione tritrofica insetto-pianta-fitoplasma. In seguito alla purificazione degli acidi nucleici, le tecniche di biologia molecolare utilizzate per la diagnosi dei fitoplasmi della FD e del LN in insetti vettori presunti o comprovati sono principalmente la nested PCR seguita da analisi RFLP; comunemente impiegata è anche la Real-Time PCR. Il marcatore genetico più utilizzato è l'intero tratto o parte del gene ribosomico 16S rDNA. Nell'ambito dello studio degli insetti vettori, le tecniche di biologia molecolare possono essere di particolare utilità per l'identificazione delle specie (stadi giovanili e individui di sesso femminile), soprattutto per quanto riguarda i cixiidi, coinvolti nella trasmissione del LN, per i quali l'identificazione morfologica è estremamente difficoltosa. La tecnica impiegata a questo scopo è la PCR seguita da analisi RFLP; i marcatori più frequentemente utilizzati sono la regione di DNA ribosomico ITS2 e la frazione di DNA mitocondriale COI. La biologia molecolare viene anche impiegata nello studio dei microrganismi simbionti degli insetti vettori, che rappresentano un nuovo possibile strumento nel contenimento delle fitoplasmosi di interesse viticolo, tramite lo sviluppo di strategie di controllo simbiotico. Per lo studio della composizione delle comunità microbiche spesso sono impiegate tecniche di biologia molecolare basate sulla PCR seguita da separazioni elettroforetiche in condizioni particolari, tra cui l'LH-PCR, la DGGE, la T-RFLP, o la SSCP. Il DNA bersaglio per queste analisi è, così come per i fitoplasmi, il DNA ribosomico 16SrDNA.