CINETICHE DI OSSIDAZIONE DEI CAROTENOIDI IN PLASTIDI ISOLATI DA DIVERSI GENOTIPI DI PATATA E PESCO: VALUTAZIONE DEL RUOLO DELLA CCD4

Many studies have identified Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4 (CCD4) as a possible control factor of carotenoid accumulation. Indeed an inverse correlation between its expression and the concentration of carotenoids exists. Therefore the aim of this work was to measure levels of β-carotene hydrolysis in isolated chromoplasts from fruits of genotypes of peaches, in their four maturation phases. Similar determination were also made to isolated chromoplasts of tubers of potato genotypes differing in the overall concentration and type of carotenoids. Finally, the same determinations were performed on peach by using also 10'-apo-β-10'-carotenal as substrate. In the case of fresh samples the material was taken still frozen, was comminuted into small cubes and was immediately homogenized. Then the homogenate was centrifuged, and the supernatant thus obtained was filtered to eliminate whole cells and large cellular wall fragments. Finally the filtrate was further centrifuged to obtain a sediment composed primarily of chromoplats. The samples, mainly consisting of intact chromoplasts, were lysed by resuspending the sedimented material by centrifugation in hypotonic buffer. The samples thus obtained were analyzed to determine protein concentration. The bleaching reaction begins by adding to the chromoplasts a solution of β-carotene. The samples were then incubated at room temperature and the absorbance was determined at precise intervals of time using a spectrophotometer. In the case of peach chromoplasts the protocol was slightly modified, because these samples the bleaching's activity is quickly saturated. In this case the samples are pooled in a more diluted solution of β-carotene, and the absorbance decrease is analyzed for shorter times and intervals than in the previous protocol. Similar procedures were also performed for the 10'-apo-β-10'-carotenal. To evaluate and compare the levels of activity of the various samples and eliminate the interference due to differences in the protein extraction efficiency, the enzyme activity was expressed as specific activity. The tests carried out in five varieties of peach in their four maturation stages using as the substrate β-carotene and 10'-apo-β-10'-apocarotenal didn't show a correlation between the levels of activity and the number of alleles coding for an active form of CCD4, also the variations in the levels of specific activity during the maturation process showed discordance with literature data. The results of the potato analysis showed a total lack of difference between the levels of enzymes activity in chromoplasts of genotypes that differ to their ploidy level, in the different techniques of conservation and the in carotenoid content in the tuber paste. In particular, this last factor confirms the lack of correlation between the carotenoid concentration and the levels of CCD4's expression. However some evidence was obtained for the fact that the metabolism of β-carotene and of 10'-apo-β-10'-apocarotenal is carried out by two different enzymes. Altogether the activity of CCD4 does not show to be the only factor determining the hydrolysis of carotenoids within the chromoplasts. Therefore in the future it will be necessary to identify the nature of the other enzymes able to metabolize β-carotene.

Numerosi studi hanno identificato la Carotenoid Cleavage Dioxygenase 4 (CCD4) come un possibile determinante dell'accumulo di carotenoidi. È stata infatti evidenziata una correlazione inversamente proporzionale tra la sua espressione e la concentrazione di questi fitonutrienti. Quindi lo scopo del lavoro è stato quello di misurare i livelli di idrolisi del β-carotene in cromoplasti isolati dai frutti di genotipi di pesca, nelle loro quattro fasi di maturazione, di cui è conosciuta con precisione la composizione allelica. Analoghe determinazioni sono state inoltre effettuate in cromoplasti isolati da tuberi di genotipi di patata che differiscono per la concentrazione complessiva e per la tipologia di carotenoidi presenti nella pasta del tubero, livello di ploidia e modalità di conservazione. Infine le medesime determinazioni sono state eseguite in pesco usando anche il 10'-Apo-β-10'-carotenale come substrato. Il campione viene sminuzzato in piccoli cubetti, o polverizzato, ed immediatamente omogeneizzato in soluzione isotonica. Dopo che l'omogenato è stato centrifugato, il supernatante così ottenuto è stato filtrato in modo da eliminare cellule intere e grossi frammenti di parete. Il filtrato è stato infine ulteriormente centrifugato ottenendo un sedimento composto principalmente da cromoplasti. Per determinare i livelli di bleaching del preparato ottenuto lisando i cromoplasti in tampone ipotonico vengono posti in una piastra fornita da pozzetti con tampone ipotonico. La reazione viene avviata aggiungendo in ogni pozzetto una soluzione di β-carotene opportunatamente diluita. I campioni vengono quindi incubati a temperatura ambiente determinandone a intervalli precisi di tempo l'assorbanza tramite spettrofotometro. Procedure analoghe sono state eseguite anche per il 10'-apo-β-10'-carotenale. Per valutare e confrontare i livelli di attività dei vari preparati ed eliminare l'interferenza dovuta a differenze nell'efficienza di estrazione delle proteine, l'attività enzimatica è stata espressa come attività specifica. Le prove svolte nelle cinque varietà di pesca nelle rispettive quattro fasi di maturazione usando come substrato sia il β-carotene che il 10'-apo-β-10'-apocarotenale non hanno evidenziato una correlazione tra i livelli di attività e il numero di alleli codificanti per una forma attiva della CCD4, inoltre le variazioni nei livelli di attività specifica nel corso del processo di maturazione hanno mostrato discordanze con i dati di letteratura. Anche i risultati delle analisi in patata hanno mostrato una complessiva mancanza di differenze tra i livelli di attività enzimatica nei cromoplasti di genotipi che differiscono per il livello di ploidia, le diverse modalità di conservazione e il contenuto di cartenoidi nella pasta del tubero. In particolare quest'ultimo fattore conferma la mancanza di correlazione tra l'attività rilevata e i livelli di espressione della CCD4. Sono state d'altra parte ottenute evidenze in favore del fatto che la metabolizzazione del β-carotene e del 10'-apo-β-10'-apocarotenale sia attuata da due diversi enzimi. Nell'insieme, contrariamente a quanto sin qui ritenuto, l'attività della CCD4 non sembra essere l'unico fattore in grado di determinare l'idrolisi dei carotenoidi all'interno dei cromoplasti. In futuro, dunque, si cercherà di identificare la natura di questi enzimi in grado di metabolizzare il β-carotene, in modo da approfondire le conoscenze a tal riguardo.