Applicazione della tecnologia "RNA-interference" per diminuire il livello di gliadine in frumento

Wheat is a cereal belonging to the genus Triticum (Graminaceae family) and, in Italy, the species T. aestivum and T. durum are the most cultivated (about 2.8 milion ha). Like other cereals, it also contains the gluten, a multi-protein complex formed by glutenins and gliadins, two proteins that, in contact with the water, assemble themselves. In the susceptible people, the gliadins are transformed in the gastric tract (acid pH), by the enzyme tissue transglutaminase (tTG), in glutamic acid-rich peptides able to bind DQ2 e DQ8, two class II HLA molecules (Human Leucocyte antigen) thereby causing the activation of lymphocytes T located in the lamina of epithelial tissue. These cell lines migrate in sub-epithelial location, causing the proliferation of cytokines inducing apoptosis and flattening of intestinal villi. To date, this pathology has not a cure yet and only an early diagnosis as well as a gluten-free diet can ensure a good quality of life. The researcher Gil-Humanes and colleagues, in 2010, published a study aiming at silencing the genes responsible for the production of gliadins in wheat. They used the molecular technique of RNA interference that is based on the post-transcriptional mechanism which involve the failure of translation of gene subject to silencing. Some plants of the Bobwhite wheat cultivar were transformed with a construct containing the gene fragments which are capable to recognize an highly conserved domain in the genes of α- ω- and γ-gliadins, causing a reduction of the expression of these three gliadins Then, gliadins and glutenins were quantified in the transgenic wheat with a competitive TEST ELISA, using the monoclonal antibody R5, and the RP-HPLC analysis. Both the analysis showed a significant reduction of quantity of gliadins and glutenins in most of the transformed lines. To demonstrate the decreased capacity of the transgenic wheat plants to active T cells, total gluten was extracted for each transgenic line and tested in serial dilutions with T cells clones, previously extracted from celiac patients. For some lines, a 100 and 10 times reduction of the T-cells proliferative response was observed for epitopes DQ2 and DQ8, respectively. Finally bread loaves made with flour derived by transformed wheat, wild type wheat and rice have been compared. The bread made with flour derived from transgenic wheat showed sensory characteristics and rising very similar to those found for the loaves made with regular flour, but with a lower content of gliadins up to 97%. Although further studies need to be conducted to determine if these products can be suitable for celiac population consumption, the presented results provide a great opportunity to improve the quality of life for millions of people who suffer from gluten intolerance around the world.

Il frumento è un cereale appartenente alla famiglia delle Graminacee del genere Triticum. In Italia vengono coltivate prevalentemente due specie di Triticum: il T. aestivum e il T. durum, per un totale di circa 2.8 milioni di ha. Come altri cereali, anch'esso contiene il glutine, un complesso multiproteico costituito da due proteine, le glutenine e le gliadine, che, a contatto con l'acqua, si assemblano. Nei soggetti prediposti, le gliadine vengono trasformate nel tratto gastrico (pH acido) dall'enzima transglutaminasi tissutale (tTG), in peptidi ricchi di acido glutammico che si vanno a legare alle molecole HLA (Human leukocyte antigen) di classe II: DQ2 e DQ8, provocando l'attivazione di linfociti T che si trovano nella lamina propria del tessuto epiteliale. Questi migrano in sede sub- epiteliale provocando la proliferazione di citochine che inducono apoptosi cellulare e appiattimento dei villi intestinali. Ad oggi non vi è ancora alcuna cura a tale patologia perciò solo una diagnosi precoce e l'esclusione del glutine dalla dieta possono garantire una buona qualità di vita. Il ricercatore Gil-Humanes e colleghi, nel 2010, ha pubblicato uno studio che ha come scopo il silenziamento dei geni responsabili della produzione delle gliadine in frumento, utilizzando la tecnica dell'RNA interference. Tale tecnica si basa su un meccanismo post-trascrizionale che si conclude con la mancata traduzione del gene sottoposto a silenziamento. Alcune piante della cultivar Bobwhite di frumento (genotipi BW208 e BW2003) sono state trasformate con un costrutto contenente frammenti genici in grado di riconoscere un dominio altamente conservato nei geni delle α-, ω- e γ-gliadine, provocando una riduzione dell'espressione di tutte e 3 le gliadine, visibile su gel di acrilammide. In seguito sono state quantificate le gliadine e glutenine totali presenti nel frumento transgenico attraverso un TEST ELISA competitivo, utilizzando l'anticorpo monoclonale R5 e attraverso l'analisi RP-HPLC. Entrambe le analisi hanno mostrato una riduzione notevole della quantità di gliadine e glutenine nella maggior parte delle linee di frumento trasformate. Per dimostrare la diminuita capacità del frumento transgenico di provocare l'attivazione delle cellule T, sono state estratte, per ogni linea transgenica, le proteine totali del glutine e testate in diluizioni seriali con cloni di cellule T precedentemente estratte da pazienti celiaci. Per alcune linee si è riscontrata una risposta proliferativa delle cellule T 100 e 10 volte inferiore rispettivamente per gli epitopi DQ2 e DQ8. Infine sono state messe a confronto delle pagnotte di pane prodotte con farina di frumento trasformato, di frumento wild type e di riso. Il pane prodotto con la farina derivante dal frumento silenziato ha mostrato caratteristiche sensoriali e di lievitazione molto simili a quelle rilevate per le pagnotte prodotte con farina normale, ma con un contenuto gliadina inferiore fino al 97%. Anche se ulteriori studi devono essere fatti per determinare se il prodotto può essere consumato dalla popolazione celiaca generale, i risultati presentati offrono una grande opportunità per migliorare la qualità della vita di milioni di persone che soffrono di intolleranza al glutine in tutto il mondo.