Characterization of H67D HFE polymorphism's impact in pancreatic cancer progression

HFE is the most frequently mutated gene in hereditary hemochromatosis, a disease in which iron accumulates in organs leading to toxicities. Worldwide, two main polymorphisms in HFE protein have been observed, namely C282Y and H63D. Even if associated to milder iron accumulations, H63D polymorphism presence increases the risk of cancer development and aggressiveness. As observed in studies about pancreatic cancer patients, the presence of H63D leads to a higher resectability followed, however, by a lower survival after surgery. Based on the known consequences of iron accumulation, the aim of this thesis was to evaluate the impact of H67D, the murine orthologue of H63D, on pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) progression and on anti-tumor immune response. We crossed genetically engineered mice (GEM) that spontaneously develop PDA with mice engineered to express H67D mutation (HfeH67D). Histological analysis of GEM showed that H67D polymorphism accelerated PDA progression, increased the number of metastases to liver and lungs and seemed to alter the composition of infiltrating immune cells. Accordingly, these mouse models had also a reduced overall survival compared to controls. In a subcutaneous tumor model, mice carrying the H67D mutation immunized with PDA cells that express ovalbumin (OVA) displayed an increased production of anti-OVA IgG antibodies without, however, any reduction in tumor growth. In addition, splenocytes derived from H67D immunized mice produced higher levels of IL-4 and reduced levels of IFN compared to wild-type mice. Consistently with those data, CD4+ T cells, isolated from H67D mice and polarized in vitro into the three main subclasses of T helper cells (Th0, Th1 and Th2), confirmed their tendency to skew towards a Th2 phenotype (IL4 producing). Thus, H67D polymorphism worsens PDA progression and impacts on the activation of immune cells, representing a promising biomarker to define disease prognosis that deserves to be further investigated.

HFE è il gene più frequentemente mutato nei pazienti affetti da emocromatosi ereditaria, una malattia in cui il ferro si accumula negli organi portando allo sviluppo di tossicità. Sono stati osservati due polimorfismi principali del gene HFE a livello mondiale: C282Y e H63D. H63D è associato ad accumuli di ferro meno importanti rispetto a C282Y. Il polimorfismo H63D aumenta il rischio di sviluppare tumori e ne aumenta l’aggressività. È stato osservato che la presenza di H63D in pazienti affetti da tumore al pancreas porta allo sviluppo di tumori più frequentemente operabili; tuttavia, i pazienti sopravvivono meno dopo la chirurgia. Considerando gli effetti esercitati dall’accumulo di ferro sulle cellule tumorali e sulle cellule immunitarie, l’obiettivo di questa tesi era di valutare l’impatto di H67D, l’ortologo murino di H63D, sulla progressione dell’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDA) e sulla risposta immunitaria antitumorale. Abbiamo quindi incrociato topi geneticamente modificati (GEM), che sviluppano spontaneamente PDA, con topi ingegnerizzati per esprimere la mutazione H67D (HfeH67D). Analisi istologiche dei tumori raccolti da questi modelli hanno evidenziato come il polimorfismo H67D sia in grado di accelerare la progressione del tumore pancreatico, di aumentare il numero di metastasi ai polmoni e al fegato e di alterare la composizione delle cellule immunitarie infiltranti il tumore. Inoltre, gli animali con questa mutazione presentano anche una ridotta sopravvivenza rispetto ai corrispettivi wild-type. In modelli sottocute di tumore, immunizzati con cellule di PDA che esprimevano ovalbumina (OVA), la presenza di H67D, pur accelerando la crescita tumorale come nei modelli spontanei, ha evidenziato la maggior capacità di produrre anticorpi anti-OVA della classe IgG. Abbiamo anche osservato che gli splenociti derivati da topi H67D immunizzati hanno prodotto più IL-4 e meno IFN rispetto ai controlli wild-type che evidenziano una loro propensione a indurre un differenziamento di linfociti T helper di tipo 2 (Th2). Analoghi risultati sono stati ottenuti polarizzando in vitro cellule CD4+ isolate da topi H67D nelle tre classi principali di linfociti T helper: Th0, Th1, Th2. Infatti, le cellule CD4+ derivate dai topi H67D hanno una tendenza a polarizzare più in senso Th2 rispetto ai controlli. In conclusione, il polimorfismo H67D è in grado di accelerare significativamente la progressione del tumore pancreatico e di alterare la funzione delle cellule immunitarie, rappresentando quindi un promettente biomarcatore prognostico, che necessita di essere ulteriormente studiato.