Caratterizzazione di MTPS4: una terpene sintasi che interviene nella produzione di composti organici volatili nelle rose

Roses belong to the genus Rosa L. of the Rosaceae family, comprising about 180 species and thousands of cultivars. All the species are woody perennials and have conspicuous showy flowers with five petals. Because of their economical importance it can be interesting to choose roses as an object of research. The research on rose floral fragrance focused on its chemical elucidation, coupled with chemical synthesis to produce the large quantities demanded by the perfume and food industries. The elucidation of the biosynthetic pathways of the major fragrance compounds (phenylpropanoids, fatty acid derivatives, and terpene) with the enzymes and genes involved in the molecular mechanisms is therefore important. In many rose varieties, terpenes (such as geraniol, nerol, linalool) are the main compounds present in scent. Despite the importance of terpenes for the scent of many rose cultivars, the biosynthetic pathway of these compounds is not well known in these species. I concentrated my work on a putative monoterpene synthases which was named MTPS4. My objective was to characterize its function and to identify the products of this enzyme. A full length cDNA corresponding to MTPS4 had been cloned prior to my arrival in the BVpam laboratory of the 'Université de Saint-Etienne'. In a first approach the sequence of this cDNA was analyzed in order to more precisely identify homologies to mono or sesqui terpene synthases. MTPS4 enzymatic activity was then studied using two complementary strategies. In the first, recombinant MTPS4 was expressed in a bacterial expression system, prior to protein purification, in vitro enzymatic activity on substrates GPP or FPP and characterization of products by GC-MS analysis. Alternatively, the second strategy was to produce MTPS4 in planta (Nicotiana benthamiana) following transient expression. At this stage two different procedures were used to assess the activity of this protein. In the first, the compounds produced by the transformed leaves were directly analyzed by GC-MS. However, since no information was available on the ability of this tobacco cultivar to produce terpenes, an alternative procedure was used in case an insufficient amount of GPP and FPP was present in the plant: proteins produced by transformed leaves were extracted and incubated with the mono or sesquiterpene synthase substrates. The compounds produced in vitro where subsequently analyzed by GC-MS. These different analysis have shown that MTPS4 is a monoterpene synthase which produces linalool as a single product. The sequence of MTPS4 was also compared with sequences of different linalool synthases issued from different plants. Finally the production of linalool in different varieties was measured by GC-MS. The four varieties analyzed (Old Blush, Papa Meilland, Rouge Meilland, McCartney) have a very low linalool production, which correlates with a weak expression of MTPS4 according to EST sequencing data and preliminary RT-PCR experiment performed on 'Papa Meilland', 'Rouge Meilland' and 'McCartney' flowers.

Le rose appartengono al genere Rosa L., che comprende circa 180 specie, centinaia di varietà e fanno parte della famiglia delle Rosaceae. Tutte le specie di rosa sono perenni e hanno fiori con cinque petali. Il genere Rosa è molto importante dal punto di vista economico, infatti le rose rappresentano il 20% delle piante ornamentali commercializzate ogni anno. Per molti anni le rose sono state utilizzate per la produzione di oli essenziali utilizzati nell'industria dei profumi e come aromatizzanti nelle industrie alimentari. Gli studi di ricerca sono stati indirizzati alla delucidazione dei composti chimici caratterizzanti gli oli essenziali e alla sintesi chimica necessaria a produrre in grandi quantità i composti richiesti dalle aziende alimentari ed essenziere. In molte varietà di rose, i terpeni (come geraniolo, nerolo e linalolo) sono i principali composti volatili caratterizzanti il profumo. Nonostante l'importanza dei terpeni, la via biosintetica di questi composti non è nota nelle rose. Il mio lavoro è stato incentrato su una monoterpene sintasi putativa, la MTPS4, con l'obiettivo di caratterizzarne la funzione e identificarne i prodotti. Al mio arrivo al laboratorio BVpam dell' 'Université de Saint-Etienne' ho potuto lavorare direttamente sul cDNA corrispondente alla sequenza di MTPS4, clonato in precedenza. Come primo approccio la sequenza di questo cDNA è stata analizzata in modo da identificare più precisamente omologie con mono o sesqui terpene sintasi. L'attività enzimatica di MTPS4 è stata poi studiata utilizzando due strategie complementari: dapprima la proteina ricombinante MTPS4 è stata espressa in batterio, in questo caso la proteina è stata purificata, l'attività enzimatica è stata testata fornendo come substrati GPP e FPP, infine si sono caratterizzati i prodotti con l'analisi GC-MS. La seconda strategia è stata quella di produrre la proteina MTPS4 in pianta (Nicotiana benthamiana) in seguito a espressione transiente. In questo caso due diverse procedure sono state utilizzate per valutare l'attività di questa proteina. In un caso i composti prodotti dalle foglie trasformate sono stati analizzati direttamente in GC-MS. Inoltre una procedura alternativa è stata utilizzata nel caso in cui la pianta di tabacco producesse una quantità insufficiente di substrato necessario alla biosintesi dei composti di interesse. Le proteine prodotte dalle foglie trasformate sono state quindi estratte e incubate con i substrati necessari alle sesqui- o alle mono- terpene sintasi (rispettivamente FPP o GPP). I composti prodotti in vitro sono stati poi analizzati in GC-MS. Queste diverse analisi hanno mostrato che MTPS4 è una monoterpene sintasi che produce come prodotto singolo linalolo. Infine si è ritenuto interessante andare a valutare la produzione di linalolo in diverse varietà di Rosa tramite l'analisi GC-MS. Le quattro varietà analizzate (Old Blush, Papa Meilland, Rouge Meilland, McCartney) hanno rivelato avere una bassa produzione di linalolo, confermando i risultati ottenuti con il sequenziamento di EST che riportavano una bassa espressione di MTPS4. Inoltre precedenti analisi di RT-PCR fatti sulle varietà di 'Papa Meilland','Rouge Meilland', e 'McCartney' mostravano bassissimi livelli di espressione di MTPS4. Questi risultati portano alla conclusione che l'enzima MTPS4, nelle varietà analizzate, non è coinvolto nella produzione dei maggiori composti volatili che danno il caratteristico profumo alle rose.