Attività delle Catecolo 1,2 diossigenasi per la detossificazione e valorizzazione delle biomasse di scarto

La catecolo 1,2 diossigenasi appartiene alla classe delle ossidoreduttasi , sottoclasse delle ossigenasi e catalizza la conversione di catecolo in acido cis ,cis - muconico.Si trova sia in batteri Gram positivi che Gram negativi.Tra questi, la catecolo 1,2 diossigenasi Iso B da Acinetobacter radioresistens S13 è oggetto del presente lavoro. ArC1,2 DO Iso B è un enzima citosolico omodimerico ,diverso dall'altra isoforma , Iso A, per il peso molecolare e la condizione di espressione. Alcuni residui chiave coinvolti nel legame del substrato , sono stati identificati nel sito attivo : Leu 69 , Ala 72 , Ile 101 . Sulla base di questa conoscenza , strategie di mutazione sono stati progettate per questa proteina in modo da consentire l'alloggiamento di substrati più ingombranti , dando proprietà di riconoscimento e catalisi del tutto nuove o migliorando i parametri cinetici della conversione del substrato. Le Catecolo 1,2 diossigenasi sono state ampiamente studiate per il loro ruolo chiave nella degradazione aerobica di composti aromatici, dato che il catecolo , è un intermedio comune nell via catabolica degli aromatici . Queste molecole tossiche derivano sia da fonti industriali ( xenobiotici ) che naturali (derivati della lignina ) e sono largamente diffuse nei terreni. La proposta di sviluppo di un biocatalizzatore efficiente per applicazioni biotecnologiche, come la biotrasformazione di composti tossici in prodotti utili ed ad alto valore aggiunto e / o la produzione di bio - energia, è un tema importante nella rimozione dei rifiuti industriali e agro ¿industriale ed è il leitmotiv di questo lavoro.Le acque di vegetazione (OMWW) costituiscono il più abbondante sottoprodotto del processo di produzione di olio di oliva e per il suo alto carico organico ,principalmente per la presenza di composti fenolici, rappresenta un grande problema d'inquinamento ambientale. Più di 30 molecole sono state identificate , e tra queste,l' idrossitirosolo è il più abbondante , seguito da acido caffeico , acido ferulico, acido vanillico, acido p - cumarico, catecolo e 4-mel-catecolo. Nel presente lavoro viene indagata l'attività di ArC1,2DO WT e L69A verso idrossitirosolo puro e verso le acque di vegetazione e confrontata con metodi spettrofotometrici e cromatografici. L69A ha dimostrato un'inversione di specificità verso catecoli sostituiti in posizione 4 e per questo motivo è stato selezionato come un buon candidato per la degradazione dell' idrossitirosolo. WT e L69A mutanti sono stati espressi e purificati , la loro concentrazione ed i parametri cinetici sono stati stimati. L69A ha mostrato una maggiore affinità e una maggiore capacità di convertire l'idrossitirosolo nel corrispondente prodotto muconato, che era 13 volte superiore.Un'estrazione liquido - liquido è stata eseguito per ottenere la frazione fenolica dall'OMWW ed è stato sviluppato un metodo di HPLC per l'identificazione del suo contenuto.Idrossitirosolo e catecolo sono stati identificati e quantificati.Per quanto riguarda le prove di attività,L69A ha nuovamente dimostrato un guadagno di funzione rispetto al WT, anche in una soluzione complessa come quella dell'OMWW,sebbene con un rendimento inferiore di quello rilevata verso l'idrossitirosolo puro.I risultati ottenuti sono molto promettenti per lo scopo iniziale di questo lavoro: l'impiego dellaArC1,2DO ed in particolare del mutante L69A come biocatalizzatori per la detossificazione e la possibile valorizzazione dell'OMWW.

Catechol 1,2 dioxygenase belong to the class of oxidoreductases, subclass of oxygenases, which acts on the substrate, by the incorporation of two atoms of oxygen. It catalyses the conversion of catechol in cis,cis-muconic acid, and it is found in both Gram negative and Gram positive bacteria. Among these, catechol 1,2 dioxygenase Iso B from Acinetobacter radioresistens S13 is the object of the present work. ArC1,2 DO Iso B is an homodimeric cytosolic enzyme, different from the other isoform, Iso A, for molecular weight and condition of expression. Some key residues involved in substrates binding, were identified in the active site: Leu 69, Ala 72, Ile 101. On the base of this knowledge, protein mutation strategies were designed in order to allow the housing of more bulky substrates, giving entirely novel recognition and catalysis properties or enhancing the kinetic parameters of substrates conversion. Catechol 1,2 dioxygenases are widely studied for their key role in the aerobic degradation of aromatic compounds, since their natural substrate, catechol, is a common intermediate in aromatics catabolic pathway. These toxic molecules derive either from industrial (xenobiotics) or natural sources (lignin derivatives) and they are largely spread in soils. The proposal of development of an efficient biocatalyst for biotechnological applications, such as biotransformation of toxic compounds into fine chemicals and high added-value products and/or bio-energy production, is an important issue in the removal of industrial and agro-industrial waste-biomasses and is the leitmotiv of this work. Olive Mill Wastewater (OMWW) is the most abundant by-product of olive oil production process and due to its high organic load, mainly for the presence of phenolic compounds, it represent a great pollution problem. More than 30 phenolic molecule were identified, among these, hydroxytyrosol, is the most abundant, followed by caffeic acid, ferulic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, catechol and 4-methyl-catechol. In the present work the activity of ArC1,2DO WT and L69A mutant towards pure hydroxytyrosol and OMWW extract is investigated and compared by spectrophotometric and HPLC methods. L69A mutant demonstrated an inversion of specificity towards 4-substituted catechols and for this reason was selected as a good candidate for hydroxytyrosol degradation. WT and L69A mutant were expressed and purified, their concentration and kinetic parameters were estimated. L69A shown a greater affinity and an increased ability to convert hydroxytyrosol in the corresponding muconate product, that was 13 times higher in 5 minutes reaction. A liquid-liquid extraction was performed to obtain the phenolic fraction from OMWW and a HPLC method was developed for identification of its content. Hydroxytyrosol and catechol were identified and quantified. As for the activity trials, L69A mutandemonstrated again a gain of function compared to the WT, also in a complex solution like OMWW, albeit with a lower efficiency than that found towards pure hydroxytyrosol. The obtained results were very promising for the initial purpose of this work: the employment of catechol 1,2 dioxygenases and in particular of L69A mutant as biocatalysts for detoxification and possible valorisation of OMWW.