Espressione genica in protocormi micorrizici dell'orchidea Serapias vomeracea

Purpose of the work The purpose of this thesis is study gene expression in orchid mycorrhiza with advanced tools like laser microdissection and New Generation Sequencing (NGS). The study is focused on the early stage of the interaction because all orchids, that can feature different trophic strategies as adults, share at this stage an intermediate developmental structure, called protocorm, that is completely dependent on the fungus for nutrition. Background Orchid seeds, or ¿dust seeds¿, contain no energy reserves and a partially developed embryo. Seed colonization by the symbiotic fungus promotes the formation of the protocorm, an achlorophyllous intermediate stage that precedes seedling development. In the protocorm cells, fungi produce hyphal coils called pelotons, which, like the intracellular structure of other mycorrhizal fungi, seems to be the site of nutrient exchange. The protocorm is characterized by a heterotrophic metabolism and grows thanks to the fungus, which provides the plant with nutrients, including organic carbon. The interaction between the orchid and its fungal partner seems unstable when compared to other mycorrhizal symbioses, suggesting a strong antagonism. Starting from preliminary transcriptomic data, some fungal and plant genes were selected to evaluated expression in mycorrhizal protocorms: a Class II cellobiohydrolase (CellobF1), a Class III chitinase (ChitinP3), two mannose binding lectins (LecP3, LecP5), two metalloproteases (MpteaseF2, MpteinaseF1), one pathogenesis related protein (PathogR1), two stress induced proteins (WoundP2, WoundP3) and four nodulins (NodP1, NodP6, NodP9, NodP10). With the aim of a laser microdissector, different cell type in the S. vomeracea mycorrhizal protocorms were isolated: cells containing metabolically active pelotons, cells with collapsed pelotons or non colonized cells. Many plant genes were induced by the presence of the fungus and were not expressed in the asymbiotic protocorms. In this group were ChitinP3, LecP3, PathogR1, WoundP3, NodP1 and NodP9. Only the NodP6 gene showed a lower expression in the presence of the symbiotic fungus. For other genes, like LecP5, WoundP2 and NodP10, there were no significant changes in the expression profile. The most interesting result was the NodP1 expression profile; this gene encodes for a protein with high homology with a phicocyanin nodulin-like of M. truncatula , is expressed only in mycorrhizal cells and the expression is enhanced in cells containing collapsed pelotons. This gene appears to be a specific marker for the mycorrhizal cells. The RT-PCR did not reveal a differential expression pattern of the fungal genes in the cells containing different peloton stages. However an RNA-seq experiment has allowed the comparison of the expression profiles in the symbiotic and asymbiotic fungus. Conclusion The results show that, similarly to other mycorrhizal symbioses, the interaction between the two partners involves a transcriptional change in the mycorrhizal cells, with a downregolation of some genes and an upregolation of others. Considering the small number of genes analyzed, these preliminary data show that, like in other mutualisitic interactions some nodulines are expressed also in orchid mycorrhiza and that, contrary to what was suggested by some authors since early '900, this interaction seems to be closer to a mutualistic interaction, although finely regulated, than to a pathogenic interaction.

Scopo del lavoro Scopo della tesi è stato quello di studiare l'espressione genica nelle micorrize delle orchidee con strumenti avanzati quali microdissezione laser e Next Generation Sequencing. In particolare, sono state considerate le fasi precoci della interazione pianta-fungo in quanto tutte le orchidee condividono una fase intermedia nello sviluppo delle giovani plantule: il protocormo. Lo scambio di nutrienti tra fungo e pianta nel protocormo è stato oggetto di studi classici di fisiologia, mentre sono assenti in letteratura dati di biologia molecolare. Background I semi delle orchidee, o dust seeds, sono infatti privi di riserve energetiche e presentano un embrione solo parzialmente sviluppato. La colonizzazione del seme da parte di un simbionte fungino induce l'embrione a formare il protocormo, uno stadio che precede la formazione della giovane plantula. Nelle cellule del protocormo il fungo sviluppa un gomitolo ifale chiamato ¿peloton¿ che sembra essere il luogo preferenziale degli scambi nutrizionali. Il protocormo è caratterizzato da un metabolismo eterotrofo e si accresce grazie alla presenza del fungo simbionte, che trasporta alla pianta nutrienti nei quali è incluso il carbonio in forma organica. L'interazione tra l'orchidea e il partner fungino sembra avere una natura molto più precaria rispetto ad altre simbiosi micorriziche, ed è stata suggerita una natura fortemente antagonista del rapporto pianta-fungo. Risultati Partendo da informazioni preliminari di trascrittomica, sono stati selezionati alcuni geni vegetali e fungini di cui valutare l'espressione: cellobioidrolasi fungina di classe II (CellobF1), chitinasi vegetale di classe III (ChitinP3), due lectine leganti mannosio di origine vegetale (LecP3 e LecP5), due metalloproteasi fungine (MpteaseF2 e MpteinaseF1), una proteina correlata a patogenesi in vegetali (PathogR1), due proteine indotte da stress (WoundP2, e WoundP3) e quattro fattori di nodulazione (NodP1, NodP6, NodP9 e NodP10). Con l'aiuto del microdissettore laser è stato possibile isolare diversi tipi cellulari nei protocormi micorrizati di S. vomeracea. Molti dei trascritti vegetali selezionati sono risultati indotti dalla presenza del fungo e totalmente assenti nei protocormi asimbiotici. In questo gruppo troviamo ChitinP3, LecP3, PathogR1, WoundP3, NodP1 e NodP9. Solo NodP6 mostra un calo di trascrizione in presenza del fungo mentre invece gli altri trascritti, ovvero LecP5, WoundP2 e NodP10 sono presenti sia nei protocormi asimbiotici che in quelli colonizzati. Il risultato più interessante è il profilo di espressione di NodP1, un gene che codifica una proteina ad alta omologia con una fitocianina nodulin-like di M. truncatula, espressa solo nelle cellule micorrizate e con un livello di espressione particolarmente elevato nelle cellule con pelotons collassati. Un esperimento di RNA-Seq condotto parallelamente al sequenziamento del genoma di T. calospora ha consentito di confrontare l'espressione genica del fungo durante la simbiosi rispetto alla crescita in coltura pura. Conclusioni I risultati ottenuti in questo lavoro indicano che l'interazione fra i due partner porta ad un cambiamento trascrizionale delle cellule micorrizate, con repressione di alcuni geni a favore di una induzione di altri. Questi primi dati mettono in evidenza l'espressione di noduline e suggerendo che sia un'interazione mutualistica finemente regolata.