Biomarcatori di sicurezza in ambito preclinico: perchè e come si misurano

The degree paper presented is the result of work carried out at the Ligand-Binding Assay (Innovative BioAnalytics) laboratory, part of the global NBE-DMPK (New Biological Entities – Drug Metabolism and Pharmacokinetics) function of the "Healthcare" division of the pharmaceutical company Merck KGaa with headquarters in Darmstadt (Germany). The aim of the work was to contribute to the selection of a kit for the evaluation of safety biomarkers in preclinical toxicology studies, specifically the evaluation of 9 cytokines: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, IP-10, INF-gamma, TNF-beta in non-human primate serum samples was carried out. Three kits based on Luminex technology from three different suppliers and one kit based on Gyrolab technology were considered:  Kit Invitrogen,“NHP, ProcartaPlex, Mix & Match 9-plex (ThermoFisher scientific)”  Kit Millipore Sigma, “Milliplex MAP Kit, non-human primate cytokine/chemokine/growth factor panel A magnetic bead panel, 96 well Plate Assay”  Kit R&D Systems “Luminex® Performance Assay, NHP XL Cytokine Premixed Kit”  Kit Gyros, “Gyrolab® Assay Protocol Human/Cynomolgus monkey” All the kits used are based on "ligand-binding assay" techniques with the use of primary capture antibodies and secondary antibodies conjugated with different molecules to reveal the signal produced following the formation of the immunocomplex. For each kit, several tests were performed using individual sera purchased, taken from monkeys not treated with any molecule to evaluate the accuracy and usability in terms, for example, of sample volume needed, total processing time, cost of the kit. Based on the results obtained, the kit produced by Thermo Fischer Scientific was chosen and then subjected to a reduced qualification based on the Context of Use (COU) or according to its use in the preclinical setting. The acceptance criteria defined for qualification have been met and therefore the kit will be used for the analysis of samples from toxicology studies.

L’elaborato di laurea presentato è il risultato di un lavoro svolto presso il laboratorio Ligand-Binding Assay (Innovative BioAnalytics), facente parte della funzione globale NBE-DMPK (New Biological Entities – Drug Metabolism and Pharmacokinetics) della divisione “Healthcare” dell’azienda farmaceutica Merck KGaa con sede generale a Darmstadt (Germania). Lo scopo del lavoro è stato quello di contribuire alla selezione di un kit per la valutazione dei biomarcatori di sicurezza nell’ambito di studi di tossicologia preclinica, nello specifico è stata effettuata la valutazione di 9 citochine: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, IP-10, INF-gamma, TNF-beta in campioni di siero di primate non umano. Sono stati presi in considerazione tre kit basati su tecnologia Luminex di tre diversi fornitori e un Kit basato su tecnologia Gyrolab:  Kit Invitrogen,“NHP, ProcartaPlex, Mix & Match 9-plex (ThermoFisher scientific)”  Kit Millipore Sigma, “Milliplex MAP Kit, non-human primate cytokine/chemokine/growth factor panel A magnetic bead panel, 96 well Plate Assay”  Kit R&D Systems “Luminex® Performance Assay, NHP XL Cytokine Premixed Kit”  Kit Gyros, “Gyrolab® Assay Protocol Human/Cynomolgus monkey” Tutti i kit utilizzati si basano su tecniche di “ligand-binding assay” con l’utilizzo di anticorpi di cattura primari e anticorpi secondari coniugati con diverse molecole allo scopo di rivelare il segnale prodotto in seguito alla formazione dell’immunocomplesso. Per ciascun kit sono state eseguite diverse prove utilizzando sieri individuali acquistati, prelevati da scimmie non trattate con alcuna molecola al fine di valutare la precisione e l’utilizzabilità in termini, ad esempio, di volume di campione necessario, tempo totale di processamento, costo del kit. Sulla base dei risultati ottenuti, è stato scelto il kit prodotto da Thermo Fischer Scientific che è quindi stato sottoposto a una ridotta qualifica sulla base del Context of Use (COU) ovvero in funzione del suo utilizzo in ambito preclinico. I criteri di accettazione definiti per la qualifica sono stati soddisfatti pertanto il kit sarà utlizzato per l’analisi di campioni provenienti da studi di tossicologia.