Tecniche per la rilevazione di Legionella in campioni ambientali

Legionella is an environmental bacteria endemic of fresh water systems where it multiply by parasitizing within protozoan hosts, survives in planctonic form or grows within biofilms. It is a Gram-negative bacteria rod-shaped, non-sporogenous, aerobe obliged, acid and thermotolerant, motile for the presence of one or more flagella, it represents the only genus of the Legionellaceae family with about 58 species and more than 70 serogroups. From the natural reservoir, it can easily transfer in man-made hot water systems, where it can reach very high concentrations indeed, thanks to the presence of organic and inorganic deposits. Legionella pneumophila species is the etiological agent of legionellosis (owes its name to the epidemic of pneumonia that in 1976 struck some legionnaires at a convention in a hotel in Philadelphia); in humans is able to cause two kinds of infection: Legionnaires' disease, a severe and potentially fatal form of pneumonia, and the milder Pontiac fever. The contraction of the disease mainly occurs in subjects with risk factors: advanced age, consumption of alcohol and smoke, immunosuppression/deficiency and chronic diseases; in most cases it affects male individuals. The infection occur by inhalation or aspiration of aerosols produced by any system assigned to air-conditioning or the supply, distribution and/or storage of water containing high concentrations of the bacteria. As far as its isolation is concerned, the cultural technique involves sample filtration and/or centrifugation, heat and acid decontamination treatments to reduce the growth of unwanted bacteria, and following inoculum on selective medium. Numerous studies have been carried out for the formulation of media more and more selective towards the target microorganism and containing the adequate supplements for the inhibition of the environmental non target concomitant bacterial microflora. Nowadays, the most commonly used medium contains buffered agar, yeast extract, activated charcoal, α-ketoglutarate, cysteine, ferric pyrophosphate, glycine, vancomycin, polymyxin B and cycloheximide. After 72 hours colonies appear small, with slightly convex morphology and regular edges, of various colors; the most characteristic feature is the ground-glass aspect if observed with a low power stereomicroscope. Colonies with these characteristics are considered legionellae potentially belonging to Legionella genus, therefore subcultured on differential growth media with or without cysteine. Growth on the medium containing the amino acid and the absence of growth on the culture medium that lacks of that, allows the colony to be defined as 'presumed' Legionella. For certain identification of the isolates thus obtained, we can use techniques based on immunofluorescence assay, microagglutination and immunoassay. Moreover, we can use techniques based on the amplification of bacterial DNA through qualitative and quantitative PCR or based on gas chromatography and mass spectrometry optimized for searching specific biochemical markers existing in the cellular wall carbohydrate composition, on the fatty acid profile of Legionella lipopolysaccharides or on chemotaxonomical criteria. However, it is important to underline that all these techniques are employed on bacterial isolates, and therefore the isolation on selective media, albeit less reliable, is fundamental for the detection and identification of Legionella in clinical and environmental samples.

Legionella è un batterio ambientale endemico dei sistemi naturali di acqua dolce, dove si moltiplica parassitizzando ospiti come i protozoi, sopravvive in forma planctonica o cresce all'interno di biofilm. Batterio Gram-negativo di forma bastoncellare, asporigeno, aerobio obbligato, acido e termotollerante, mobile per la presenza di uno o più flagelli, rappresenta l'unico genere della famiglia delle Legionellaceae con circa 58 specie e oltre 70 sierogruppi. Dal serbatoio naturale, può facilmente trasferirsi nei sistemi idrici artificiali ad acqua calda, dove raggiunge concentrazioni anche molto elevate per la presenza di residui organici e inorganici. La specie Legionella pneumophila è l'agente eziologico della legionellosi (deve il nome all'epidemia di polmonite che nel 1976 colpì dei legionari partecipanti ad un convegno in un hotel a Philadelphia); nell'uomo è in grado di provocare due tipi di infezione: la malattia dei Legionari, grave forma di polmonite potenzialmente letale, e la più lieve febbre di Pontiac. La malattia colpisce prevalentemente soggetti che presentano fattori di rischio: età avanzata, consumo di alcool e fumo, immunodepressione/deficienza, patologie croniche, e soprattutto individui di sesso maschile. L'infezione avviene per inalazione o aspirazione di aerosol prodotto da qualsiasi apparato adibito a condizionamento dell'aria o erogazione, distribuzione e/o stoccaggio di acqua con un'elevata concentrazione del batterio. Per quanto riguarda il suo isolamento, la tecnica colturale prevede filtrazione e/o centrifugazione del campione, trattamento di decontaminazione termica e con acido per ridurre la crescita di batteri non desiderati e successiva semina su terreno selettivo. Numerosi studi sono stati effettuati per la formulazione di terreni sempre più selettivi nei confronti del batterio con supplementi adeguati all'inibizione della microflora batterica ambientale non target concomitante. Oggi il mezzo colturale più usato contiene agar tamponato, estratto di lievito, carbone attivo, α-chetoglutarato, cisteina, pirofosfato ferrico, glicina, vancomicina, polimixina B e cicloeximide. Dopo 72 ore si formano colonie di piccole dimensioni e vari colori, con morfologia leggermente convessa e margini regolari; il tratto più caratteristico è l'aspetto a ¿vetro smerigliato¿ se osservate allo stereomicroscopio con luce laterale a bassa intensità. Le colonie con queste caratteristiche vengono considerate sospette legionelle, e quindi subcoltivate su terreni per la crescita differenziale con o senza cisteina. La crescita su terreno che contiene l'aminoacido e l'assenza di crescita sul terreno che ne è privo consentono di definire la colonia come 'presunta' Legionella. Per un'identificazione certa degli isolati ottenuti, si usano tecniche basate su saggi di immunofluorescenza, microagglutinazione e test immunoenzimatici. È anche possibile usare tecniche basate sull'amplificazione del DNA batterico con PCR qualitativa e quantitativa o altre basate su gascromatografia e spettrometria di massa ottimizzate per cercare specifici biomarcatori presenti nella composizione glucidica della parete cellulare, in base al profilo acidico dei lipopolisaccaridi o a criteri chemiotassonomici. È importante sottolineare che tutte queste tecniche si applicano su isolati batterici, e quindi l'isolamento su mezzi selettivi, anche se meno affidabile, è fondamentale per la rilevazione e identificazione di Legionella in campioni clinici e ambientali.