Tioli implicati nell'aroma dei vini bianchi: sviluppo ed applicazione di metodi di analisi in cromatografia liquida

Thiolic compounds can influence wine aroma profile and their concentration is related to the cultivar, agronomical practices and to wine making and ageing conditions. Glutathione (GSH) is a main thiolic compound present in grape and wine. GSH is a tripeptide well known for its antioxidant property.GSH biosynthesis is connected with the methionine pathway, which provides sulfur aminoacids and S-adenosylmethione (SAM). Some volatile thiol compounds are related to pleasure and fruity notes in wine, such as grapefruit, passion fruit and box tree. These thiol-related aroma compounds (TRACs) are 3-mercaptohexan-1-ol (3MH), 3-mercaptohexyl acetate (3MHA) and 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP). Inactivated dry yeast (IDY) enriched in SAM were tested to investigate yeast GSH production. Vinification trials were carried out with Riesling and Pinot noir grapes to investigate inactivated dry yeast with different SAM content and their influence on the GSH production during the alcoholic fermentation. GSH content analysis were carried out from musts to 20 days after the sugar consumption. As well, sensorial analysis was carried out on final wines to investigate aromatic differences. Improvement of LC method to determine 3MH, 3MHA and 4MMP was carried out, starting from previously experimental results. Sample preparation and chromatographic separation were taken into account to reach a method sensibility close to TRACs perception threshold. Specifically, sample concentration, derivatization and internal standard addition were improved. Chromatographic conditions were evaluated coupling UHPLC to both FL and High Resolution Mass Spectrometry detector. Further, an analytical method for TRACs precursor was adopted, basing on previously published method, to investigated precursors content in musts. For precursor samples, the preparation involve solid-phase extraction (SPE) technique, sample concentration under nitrogen flow and injection in UHPLC-HRMS system. Quantification approach was carried out using calibration curve with GSH and cysteine.SAM enriched IDY did not show a difference in GSH production, in both IDYs used GSH production was low (4-4.1 and 12-14.9 for Riesling and Pinot respectively). Wine were evaluated through discriminative test (triangle test n=12) and no aromatic differences were found. 3MH and 3MHA derivatized with OPA are detectable in both HRMS and FL at ng/L levels. The method involved the use of 6MH as internal standard.Satisfactory analytical response were reached with external standard calibration, reaching r2=0.97 and r2=0.99 for 3MH and 3MHA respectively. Good results were obtained for both the precursors purification and identification using UHPLC-HRMS. TRACs precursors method allowed to identify GSH, oxidized glutathione, glutathionylated-3MH (GSH-3MH), cysteinalted-3MH and cysteinylglyicin-3MH. Glutathionylated 4MMP and GSH-3MH aldehyde, were found in the analyzed juice samples.

I composti tiolici possono influenzare le caratteristiche sensoriali dei vini e la loro concentrazione è influenzata dalla cultivar, dalle pratiche agronomiche e dalle condizioni di vinificazione e di affinamento. Il composto tiolico ponderalmente più abbondante nelle uve e nei vini è il glutatione (GSH), tripeptide con proprietà antiossidanti. La via metabolica di produzione del GSH nel lievito è annessa alla sintesi della metionina, da cui derivano gli amminoacidi solforati e la S-adenosilmetionina (SAM). Altri composti tiolici, ma di natura volatile, influenzano positivamente le caratteristiche aromatiche del vino conferendogli note fruttate descrivibili come pompelmo, frutto della passione e bosso. Questi composti, principalmente rappresentati da 3-mercaptoesan-1-olo (3MH), 3-mercaptoesil acetato (3MHA) e 4-mercapto-4-metilpentan-2-one (4MMP), si ritrovano nell'uva e nel mosto come precursori non volatili, coniugati al GSH o alla cisteina, Il 3MH si forma anche nel mosto a partire da GSH ed esenale. L'effetto dell'impiego di lieviti secchi inattivi arricchiti in SAM sulla produzione di GSH da parte del lievito stesso nel corso della vinificazione è stato indagato per mezzo di microvinificazioni con uve Pinot nero e Riesling. È stata monitorata l'evoluzione del contenuto di GSH dai mosti fino a 20 giorni successivi al termine della fermentazione ed è stato valutato l'effetto sensoriale sui vini finali. Partendo da precedenti risultati di ricerca, una metodica di analisi per la determinazione dei composti tiolici aromatici è stata ulteriormente migliorata. Sono state condotte prove per ottimizzare la preparazione del campione e la separazione cromatografica di 3MH, 3MHA e 4MMP al fine di consentire la loro rilevazione a livelli di concentrazione prossimi alla loro soglia di percezione. Particolare attenzione è stata rivolta alla fase di evaporazione del solvente, alla derivatizzazione, all'impiego di uno standard interno nonché alla separazione cromatografica con l'impiego di UHPLC accoppiata con i detectors a fluorescenza e High Resolution Mass Spectrometry (HRMS). Infine, è stata valutata la trasferibilità di un metodo di analisi LC-MS, descritto in letteratura, per la quantificazione dei precursori degli aromi tiolici in uva e mosto. Questo prevede che campioni di mosto vengono purificati per solid-phase extraction (SPE), concentrati sotto azoto e analizzati in LC/ESI-HRMS. Quest'ultima permette l'identificazione di molecole in base al rapporto m/z esatto. Un approccio quantitativo è stata valutato attraverso curve di calibrazione ottenute con GSH e cisteina. L'utilizzo di lieviti secchi inattivi arricchiti in SAM non ha influenzato significativamente il contenuto di GSH prodotto dai lieviti, che si è mantenuto a livelli particolarmente bassi (4-4.1 mg/L per i Riesling e 12-14.9 per i Pinot). I vini con diversi arricchitori sono risultati sensorialmente indistinguibili. Gli aromi tiolici 3MH e 3MHA derivatizzati con OPA sono rilevabili sia in FL che in HRMS a livelli di ng/L. Adeguate risposte analitiche sono state ottenute per 3MH (r2=0.97) che per 3MHA (r2=0.99) con il metodo dello standard esterno.La metodica testata per l'analisi dei precursori ha dato buoni risultati sia per la purificazione del campione sia per la separazione cromatografica in UHPLC-HRMS. Quest'ultima ha consentito di identificare GSH, glutatione ossidato, glutationil-3MH (GSH-3MH ), cisteinil-3MH e cisteinilglicil-3MH . Nei campioni di mosto analizzati è