Endogenous anabolic androgenic steroids (EAAS) are endogenous compounds that constitute the steroid profile, which is a module implemented in the Athlete Biological Passport (ABP) since 1st January 2014. The steroid profile is obtained from urine samples: it provides information on the metabolism pathway of androgenic compounds and is one of the main strategies to identify abuse of AAS in sport; the assessment of steroid profile's future possible transfer from urine to serum matrix, in order to simplify sample collection and avoid sample contamination and manipulation, is one of the challenges which anti-doping community is nowadays working on. To evaluate this possibility, when I started my internship at the Swiss Laboratory for Doping Analyses (LAD), a research project on the quantification of 5 EAAS (testosterone, epitestosterone, androstenedione, dihydrotestosterone (DHT), dehydroepiandrosterone (DHEA)) and other 6 steroid hormones (progesterone, 17αOH-progesterone, cortisol, 11-deoxycortisol, corticosterone and deoxycorticosterone) in human serum was already started and a validated ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method was ready to be implemented in routine analysis. Therefore, the aim of this Master Thesis was firstly to apply this method to analyze 1083 serum samples from the 2013 IAAF World Championship and calculate population curves of the eleven target endogenous steroids in order to obtain reference values in an elite population for each analyte. One of the principal ways to perform AAS doping is the intake of testosterone esters by oral, parenteral or transdermal administration, hence the second part of the work consisted in the development and validation of a two dimensional 2D-UHPLC-MS/MS method to identify seven different testosterone esters (testosterone acetate, propionate, isocaproate, enanthate, cypionate, decanoate and undecanoate) in human serum. Seen that testosterone esters concentration in this matrix, even after a large intake of compound, is very low (pg/mL) and not long-lasting, an important task of this project was to find the optimal sample preparation and chromatographic conditions in order to obtain a high sensitivity level. For this purpose, Supported Liquid Extraction (SLE) was selected and different solvents (dichloromethane (DCM), cyclohexane and heptane) were tested; heptane was chosen because of its high recovery and low matrix effects. Always with the aim of improving sensitivity, conventional LC and 2D-LC were evaluated and the two dimensions configuration was preferred because of its lower limits of detection. A triple quadrupole mass spectrometer was employed and characteristic MRM transitions were selected for each compound. To be implemented in routine, the method was then validated in compliance with the International Standard for Laboratories (ISL) and ISO 17025. The following criteria were evaluated: specificity, identification capability, robustness, carryover, matrix interference and limit of detection (LOD). As a proof of concept, this method was then used to analyze serum samples of 3 volunteers, who had taken testosterone undecanoate pills. Finally, the last part of the work consisted in the optimization of the sample preparation for the routine validated quantitative method for steroid hormones with the aim to possible include in the future the glucuro-or sulfoconjugated metabolites of testosterone as well as three estrogens.
Gli steroidi andorgeni anabolizzanti endogeni (SAAE) sono composti endogeni che costituiscono il profilo steroideo, il quale è un nuovo modulo dell' Athlete Biological Passport (ABP) introdotto dal 1 Gennaio 2014. Il profilo steroideo è ottenuto da campioni urinari: esso fornisce informazioni sul metabolismo dei composti androgeni e rappresenta una delle principali strategie utilizzate per identificare l'abuso di SAA nello sport. La valutazione del possibile passagio in futuro del profilo steroideo dalla matrice urinaria a quella sanguigna, la quale semplificherebbe le operazioni di prelievo dei campioni e limiterebbe la possibilità di contaminazione e manipolazione degli stessi, è uno degli obiettivi che si prefigge oggigiorno la WADA. Al fine di valutare questa possibilità, quando ho iniziato il mio tirocinio presso il Laboratoire suisse d'Analyse du Dopage (LAD), era già stato iniziato un progetto di ricerca rigusrdante la quantificazione di 11 ormoni steroidei nel siero umano ed era già stato validato un metodo UHPLC-MS/MS. L'obiettivo di questo lavoro è stato, in primo luogo, applicare questo metodo all'analisi di 1083 campioni di siero provenienti dalla 2013 IAAF World Championship e calcolare le curve di popolazione degli 11 analiti d'interesse, in modo da ottenere degli intervalli di riferimento delle loro relative concentrazioni nel siero in una popolazione di atleti professionisti. Uno dei principali modi per usare il testosterone come agente dopante è rappresentato dall'assunzione per via orale, parenterale o transdermica di esteri del testosterone, quindi la secondsa parte del lavoro ha riguardato lo sviluppo è la validazione di un metodo 2D-UHPLAC-MS/MS per l'identificazione di sette esteri del testosterone nel siero umano. Poichè la concentrazione di questi composti nel siero, anche dopo la somministrazione di una dose elevata, è piuttosto bassa e non duratura, un importante obiettivo di questo lavoro è stato ricercare una tecnica di preparazione del campione e delle condizioni cromatografiche ottimale con lo scopo di ottenere un'elevata sensibilità. E' stata dunque scelta la Suppoted Liquid Extraction (SLE) e sono stati testai diversi solventi (diclorometano (DCM, cicloesano ed eptano); è stato preferito l'eptano per via degli alti valori di rendimento d'estrazione e per i bassi effetti matrice. Sempre al fine di aumetare la sensibilità del metodo, sono state valutate sia LC tradizionale che quella a due dimensioni e quest'ultima è stata preferita per via dei piú bassi limiti di rivelabilità. Per l'analisi è stato impiegato un triplo quadrupolo e sono state scelte due caratteristiche transizioni MRM per ogni analita d'interesse. Questo metodo è stato validato in conformità con l' International Standard for Laboratories e l'ISO 17025, valutando la specificità, la capacità d'identificazione, la robustezza, il carryover, le interferenze di matrice e i limiti di rivelabilità del metodo. Per valutarne l'applicabilità ai campioni reali, il metodo pè stato infine utilizzato per l'analisi dei campioni di siero di tre volontari cui era stato somministrato del testosterone undecanoate per via orale. In conclusione, l'ultima parte del lavoro si è incentrata sull'ottimizzazione della preparazione del campione relativa al metodo per la quantificazione degli ormoni steroidei con lo scopo di includervi i metaboliti glucuro- e solfoconiugati del testosterone e tre estrogeni.
Determinazione di steroidi endogeni nel siero umano mediante UHPLC-MS/MS
PONZETTO, FEDERICO
2012/2013
Abstract
Gli steroidi andorgeni anabolizzanti endogeni (SAAE) sono composti endogeni che costituiscono il profilo steroideo, il quale è un nuovo modulo dell' Athlete Biological Passport (ABP) introdotto dal 1 Gennaio 2014. Il profilo steroideo è ottenuto da campioni urinari: esso fornisce informazioni sul metabolismo dei composti androgeni e rappresenta una delle principali strategie utilizzate per identificare l'abuso di SAA nello sport. La valutazione del possibile passagio in futuro del profilo steroideo dalla matrice urinaria a quella sanguigna, la quale semplificherebbe le operazioni di prelievo dei campioni e limiterebbe la possibilità di contaminazione e manipolazione degli stessi, è uno degli obiettivi che si prefigge oggigiorno la WADA. Al fine di valutare questa possibilità, quando ho iniziato il mio tirocinio presso il Laboratoire suisse d'Analyse du Dopage (LAD), era già stato iniziato un progetto di ricerca rigusrdante la quantificazione di 11 ormoni steroidei nel siero umano ed era già stato validato un metodo UHPLC-MS/MS. L'obiettivo di questo lavoro è stato, in primo luogo, applicare questo metodo all'analisi di 1083 campioni di siero provenienti dalla 2013 IAAF World Championship e calcolare le curve di popolazione degli 11 analiti d'interesse, in modo da ottenere degli intervalli di riferimento delle loro relative concentrazioni nel siero in una popolazione di atleti professionisti. Uno dei principali modi per usare il testosterone come agente dopante è rappresentato dall'assunzione per via orale, parenterale o transdermica di esteri del testosterone, quindi la secondsa parte del lavoro ha riguardato lo sviluppo è la validazione di un metodo 2D-UHPLAC-MS/MS per l'identificazione di sette esteri del testosterone nel siero umano. Poichè la concentrazione di questi composti nel siero, anche dopo la somministrazione di una dose elevata, è piuttosto bassa e non duratura, un importante obiettivo di questo lavoro è stato ricercare una tecnica di preparazione del campione e delle condizioni cromatografiche ottimale con lo scopo di ottenere un'elevata sensibilità. E' stata dunque scelta la Suppoted Liquid Extraction (SLE) e sono stati testai diversi solventi (diclorometano (DCM, cicloesano ed eptano); è stato preferito l'eptano per via degli alti valori di rendimento d'estrazione e per i bassi effetti matrice. Sempre al fine di aumetare la sensibilità del metodo, sono state valutate sia LC tradizionale che quella a due dimensioni e quest'ultima è stata preferita per via dei piú bassi limiti di rivelabilità. Per l'analisi è stato impiegato un triplo quadrupolo e sono state scelte due caratteristiche transizioni MRM per ogni analita d'interesse. Questo metodo è stato validato in conformità con l' International Standard for Laboratories e l'ISO 17025, valutando la specificità, la capacità d'identificazione, la robustezza, il carryover, le interferenze di matrice e i limiti di rivelabilità del metodo. Per valutarne l'applicabilità ai campioni reali, il metodo pè stato infine utilizzato per l'analisi dei campioni di siero di tre volontari cui era stato somministrato del testosterone undecanoate per via orale. In conclusione, l'ultima parte del lavoro si è incentrata sull'ottimizzazione della preparazione del campione relativa al metodo per la quantificazione degli ormoni steroidei con lo scopo di includervi i metaboliti glucuro- e solfoconiugati del testosterone e tre estrogeni.| File | Dimensione | Formato | |
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