Ruolo del gene Mecp2 associato alla sindrome di Rett nell'organizzazione degli interneuroni GABAergici corticali

Rett syndrome (RTT) is an X-linked progressive neurodevelopmental disorder occurring in 1/10,000 girls worldwide. About 90%of cases are due to mutations in the methyl-CpG binding protein-2 gene(MECP2).The role of this gene in the pathogenesis of this complex disorder is being extensively investigated in animal models.RTT is typically characterized by a broad range of deficits including loss of language skills and hand use, cognitive and motor alterations.Recent evidences suggest that RTT neurological symptoms may arise from excitation/inhibition (E/I) balance abnormalities in specific neocortical regions,however,the cellular and molecular determinants of such circuit dysfunction are unknown.While alterations of excitatory pyramidal neurons were among the first to be described in mice models,it has only recently been demonstrated an important role of Mecp2 also in interneurons.In this thesis,I focused on the understanding of the direct role of MeCP2 in the anatomical and neurochemical organization of cortical GABAergic interneurons(INs): I did so by generating Mecp2 conditional mice in which the Mecp2 gene was selectively deleted from most of the forebrain GABAergic INs (Dlx5/6-Mecp2-/y).By comparing 8 weeks-old male Dlx5/6-Mecp2-/y mice to control littermates I revealed that the mutant mice do not show overt alterations of general health conditions:Dlx5/6-Mecp2-/y mice do not exhibit differences in weight, they move normally in the home cage,they exhibit a normal smooth coat with no hair loss and do not show the characteristic hindlimb clasping.Moreover,the overall histological organization of the cerebral cortex in the Dlx5/6-Mecp2-/y seemed normal as I found that the cortical thickness,the total cell density and the soma size of layer II/III and V pyramidal neurons in this area are not altered. Next,I evaluated the organization of the main GABAergic INs subpopulations in the primary somatosensory cortex (S1) using immunohistochemistry and confocal microscopy with antibodies against MeCP2 and interneuronal markers.First,I showed that in the conditional mice MeCP2 is completely absent in the GABAergic INs subclasses that I analysed: i.e. parvalbumin- (PV),somatostatin- (SOM) and calretinin-positive (CR) cells. The densities of both the PV+ and CR+ INs are greater in Dlx5/6-Mecp2-/y,whereas the densities of both SOM+ and SOM+/CR+ subpopulations are unchanged in mutants.Interestingly,an analysis of the morphological diversity among CR+ INs revealed that is the density of the multipolar-shaped subclass to undergo an increase in Dlx5/6-Mecp2-/y mice while no density differences were shown by the bipolar-shaped cells. In conclusion, the data presented in my thesis indicate that correct levels of expression of MeCP2 are crucial for the proper organization and morphological organization of the major classes of cortical INs.Moreover, the use of a conditional mice approach allowed me to demonstrate that MeCP2 produces a direct "cell-autonomous" action on the development and correct assembly of cortical GABAergic INs.The defects affecting the organization of INs that I have shown in this thesis are most important for the alterations of the E/I balance as well as of synaptic function and plasticity in the cerebral cortex that have been associated with RTT pathological signs.I deem that the data I obtained with my experimental work can be useful to further extend our knowledge on the neurobiological bases of RTT and,I hope,to open new therapeutical

La sindrome di Rett (RTT) è un disordine dello sviluppo neurologico regressivo che colpisce 1/10.000 ragazze nel mondo.Circa il 90% dei casi è causato dalla mutazione nel gene MeCP2 legato al cromosoma X,che codifica per un modulatore della trascrizione, la proteina methyl-CpG-binding protein (MECP2).Recenti studi suggeriscono che i sintomi neurologici della RTT possono derivare dall'alterazioni dell'equilibrio tra eccitazione e inibizione (E/I) in specifici circuiti della corteccia cerebrale,le cui cause non sono chiare. Sebbene alterazioni a carico dei neuroni piramidali eccitatori alla base della patologia siano state tra le prime a essere descritte in modelli murini,solo recentemente è stato dimostrato un ruolo importante di Mecp2 negli interneuroni. Con questa Tesi ho cercato di comprendere il ruolo di MeCP2 nell'organizzazione anatomica e neurochimica degli interneuroni GABAergici corticali studiando un modello murino condizionale (Dlx5/6-Mecp2-/y) dove il gene Mecp2 è eliminato dalla maggior parte dei neuroni GABAergici del prosencefalo. Ho stabilito che i mutanti Dlx5/6-Mecp2-/y all'età di 8 settimane non presentano alterazioni macroscopiche delle caratteristiche generali rispetto agli animali di controllo.I topi Dlx5/6-Mecp2-/y non hanno differenze di peso,si muovono normalmente all'interno della gabbia, presentano un manto liscio senza perdita di pelo e non sono soggetti a ¿clasping¿. L'analisi delle caratteristiche neuroanatomiche generali degli animali Dlx5/6-Mecp2-/y ha rivelato che sia lo spessore della corteccia cerebrale sia la densità cellulare non sono alterati, cosi come le dimensioni del soma di neuroni piramidali dello strato II/III e V.Dopo,ho valutato l'organizzazione delle principali sottopopolazioni di neuroni GABAergici della corteccia somatosensoriale primaria (S1) dei Dlx5/6-Mecp2-/y a 8 settimane di età mediante immunoistochimica e microscopia confocale. Per far luce sull'organizzazione anatomica della S1,ho utilizzato anticorpi diretti contro la proteina MeCP2 e marcatori che riconoscono specifiche sottopopolazioni interneuronali. Innanzitutto, ho rilevato che MeCP2 viene eliminato dalle sottoclassi di interneuroni GABAergici che esprimono parvalbumina (PV), la somatostatina (SOM) e la calretinina (CR). Tra queste, la densità cellulare delle cellule PV+ e CR+ è aumentata negli animali Dlx5/6-Mecp2-/y, mentre il numero degli interneuroni SOM+ rimane invariato. Inoltre, non ho evidenziato variazione nella densità della sottopopolazione di cellule SOM+/CR+ nei topi Dlx5/6-Mecp2-/y. Dall'analisi dell'organizzazione morfologica delle cellule CR+ mi ha permesso di evidenziare un aumento delle cellule con forma multipolare nella S1, mentre non ho trovato differenze nella densità delle cellule CR+ di tipo bipolare. In conclusione, i dati nella mia Tesi mostrano per la prima volta che i livelli di espressione di MeCP2 sono importanti per la corretta disposizione ed organizzazione morfologica degli interneuroni all'interno dei circuiti corticali. L'utilizzo di un modello condizionale mi ha permesso di dimostrare che MeCP2 sullo sviluppo degli interneuroni ha un ruolo ¿cell-autonomous¿.I difetti degli interneuroni che ho mostrato in questa tesi sono probabilmente decisivi per la modificazione dell'equilibrio fra E/I nella corteccia cerebrale, un difetto che potrebbe alterare in modo grave la funzionalità di circuiti nervosi corticali e, almeno in parte, spiegare i difetti di importanti funzioni legate alla patologia.