Effetti antitumorali del trattamento combinato con onde d'urto extracorporee (ESW) e nanobolle caricate con doxorubicina nel carcinoma anaplastico della tiroide

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a very aggressive neoplasia, resistant to conventional treatments. Currently used chemotherapic agents (e.g. doxorubicin, paclitaxel) are not able to modify the disease evolution and have severe systemic side effects. Nanobubbles (NBs) are vehicles consisting of a gas core and a stabilizing shell, capable of carrying drugs at the tumor site through the bloodstream. This approach could have a significant impact in improving the efficacy of the drug and minimizing the side effects associated with chemotherapy. NBs may release their drug load in response to physical stimuli, such as ultrasounds, that cause oscillation and cavitation of NBs. Extracorporeal Shock Waves (ESWs), acoustic waves widely used to treat urolithiasis, determine cavitation, increase cell permeability and facilitate the entrance of antineoplastic drugs into the cells. Therefore, they may be an alternative way to trigger drug delivery from NBs. Based on this background, the aim of my work was to evaluate the cytotoxic effects of the combined treatment with doxorubicin-loaded NBs and ESWs, in ATC cells. The study was conducted on CAL-62 cells, an immortalized cell line of ATC. The cells were treated with doxorubicin, coumarin-loaded NBs, doxorubicin-loaded NBs, in the presence or absence of ESWs. I studied four types of NBs with different shell polymers: chitosan, chitosan with a low molecular weight, glycolchitosan and dextran. Data show that treatment with ESWs (0,59 mJ/mm2, 500 shots) does not affect the cell growth of CAL-62. Both dextran- and glycolchitosan-NBs enter the cells, being the glycolchitosan-NBs uptake greater; both types of NBs have not cytotoxic effects even in the presence of ESWs. At 48 hours after treatment, doxorubicin-loaded glycolchitosan-NBs have a greater cytotoxic effect with respect to treatment with doxorubicin alone; IC50 drops from 1.57 ± 0.05 &#956;M for doxorubicin alone to 1,13 ± 0,06 &#956;M for doxorubicin-loaded glycolchitosan-NBs (p<0.001). ESW treatment enhances the cytotoxic effect of both doxorubicin and doxorubicin-loaded glycolchitosan-NBs; but it's the combined treatment to have the best effect. Interestingly, treatment with doxorubicin-loaded glycolchitosan-NBs and ESWs achieves the same cytotoxic effect with a dose of doxorubicin 60% lower compared to treatment with doxorubicin alone (IC50 for doxorubicin-loaded glycolchitosan-NBs and ESWs = 0.95 ± 0.04 &#956;M). As far as the mechanism of action is concerned, my data suggest a role for ESWs in popping the bubbles and releasing the drug at the cell site. In conclusion, my study suggests the possibility of using the combination of ESWs and doxorubicin-loaded NBs as a new multi-modal approach in the treatment of anaplastic thyroid cancer, with the ultimate goal of improving prognosis and limiting systemic side effects. Further experiments with other drugs and cell lines will be needed to better understand the mechanisms of action of this combined treatment and build the bases for in vivo studies.

Il tumore anaplastico della tiroide (ATC) è una neoplasia molto aggressiva, resistente ai trattamenti convenzionali. Gli agenti chemioterapici utilizzati (doxorubicina, paclitaxel) non sono, infatti, in grado di modificarne l'evoluzione e presentano importanti effetti collaterali. Le nanobolle (NB), formate da un involucro di superficie e un core gassoso, sono in grado di trasportare i farmaci nella sede del tumore, attraverso il flusso ematico. L'utilizzo di queste nanoparticelle può garantire una maggiore efficacia antitumorale e una migliore selettività dell'azione citotossica, limitando gli effetti collaterali sistemici. Inoltre, per aumentare l'azione citotossica delle NB caricate con farmaci chemioterapici, si è associato il loro utilizzo alla stimolazione con ultrasuoni: questi provocano oscillazione e cavitazione delle NB e il rilascio del farmaco a livello del tessuto neoplastico. Le onde d'urto extracorporee (ESW), onde acustiche utilizzate in clinica per trattare l'urolitiasi, determinano fenomeni di cavitazione, aumentano la permeabilità cellulare e facilitano l'ingresso di farmaci antineoplastici; pertanto, il loro uso potrebbe rivelarsi una modalità alternativa agli ultrasuoni per la stimolazione meccanica delle NB. Scopo del presente studio è stato quello di valutare l'effetto citotossico del trattamento combinato con farmaci anti-tumorali coniugati a NB ed ESW in linee di ATC, al fine di porre le basi per un nuovo approccio di terapia antitumorale. Lo studio è stato condotto su cellule CAL-62 trattate con: doxorubicina, NB coniugate con cumarina e NB caricate con doxorubicina, in presenza o in assenza di ESW. Sono stati studiati quattro tipi di NB con un diverso polimero di superficie: chitosano, chitosano a basso peso molecolare, glicochitosano e destrano. I dati ottenuti dimostrano che il trattamento con ESW (0,59 mJ/mm2, 500 colpi) non modifica la crescita cellulare delle cellule CAL-62. Sia le NB di destrano che quelle di glicochitosano &#8213;vuote&#8214; entrano nelle cellule, ma l'ingresso delle NB di glicochitosano è maggiore; come tali, le NB non sono citotossiche nemmeno in presenza di ESW. Già a 48 ore dal trattamento, le NB di glicochitosano caricate con doxorubicina hanno un effetto citotossico maggiore rispetto al trattamento con la sola doxorubicina libera; l'IC50 scende da 1.57 ± 0.05 &#956;M a 1.13 ± 0.06 &#956;M (p<0.001). Il trattamento con ESW potenzia l'effetto citotossico sia della doxorubicina libera sia delle NB caricate con doxorubicina; il dato più interessante, tuttavia, è che il trattamento combinato con NB caricate con doxorubicina ed ESW consente di ottenere il medesimo effetto citotossico con una dose di doxorubicina inferiore del 60% rispetto al trattamento con la sola doxorubicina libera (IC50= 0.95 ± 0.04 &#956;M). Per quanto riguarda il meccanismo d'azione, i miei dati suggeriscono un ruolo delle ESW nel favorire l'esplosione delle NB e il conseguente rilascio del farmaco a livello cellulare. In conclusione, il mio studio suggerisce la possibilità di utilizzare la combinazione di ESW e NB caricate con doxorubicina come nuovo approccio multimodale per il trattamento del tumore anaplastico della tiroide, con l'obiettivo finale di migliorare la prognosi e limitare gli effetti collaterali sistemici della chemioterapia. Ulteriori esperimenti, con altri farmaci e linee cellulari, saranno necessari per comprendere meglio i meccanismi d'azione di questo trattamento combinato e costruire le basi per la sperimentazione in vivo.